قدم اول در آماده سازی نمونه استخراج پروتئین ها از منبع مورد نظر است . ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیما توسط بافر محلول سازی Solubilization Buffer صورت پذیرد . ممکن است این عمل توسط روش های متلاشی ساختن سلولها Cell disruption و بافتها انجام شود و سپس پروتئین های استخراج شده در بافر محلول سازی کاملا حل شوند . برای استخراج کامل پروتئین های داخل سلولی ، سلول باید کاملا متلاشی شود . انتخاب روش متلاشی سازی بستگی به این دارد که نمونه از چه منبع بیولوژیکی ، سلول ، بافت جامد و یا از منابع دیگری ، به دست آمده باشد . بعد از استخراج ، این نمونه ها باید برای انجام الکتروفورز دو بعدی آماده شوند . منظور از آماده سازی نمونه ، محلول ساختن حداکثر پروتئین های موجود و حفظ حلالیت آنها در حین روند الکتروفورز دو بعدی است .
هیچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هایی که توسط الکتروفورز دو بعدی مورد بررسی قرار می گیرند ، معرف کرد . در واقع ماهیت متفاوت نمونه ها امکان به کار گیری روشی یکسان را در آماده ساختن آنها برای الکتروفورز دو بعدی منتفی می سازد . از طرفی دیگر ، روش بکار گرفته شده در هر تجربه ای به هدف طراحی شده نیز بستگی دارد . برای مثال ، ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی دستیابی به پروتئین هایی با ویژگی های خاص باشد ، یا ممکن است دستیابی به نقشه کامل پروتئینهای نمونه ، از اهمیت بیشتری برخوردار باشد . در هر یک از این موارد استراتژی های انتخابی کاملا با هم تفاوت دارند . در بهینه سازی استراتژی آماده سازی نمونه باید از نتایج مورد نظر ، انتظاری مشخص داشت . باید برای ما مشخص باشد که نشان دادن نمونه به طور کامل مهمتر است ، یا به دست آوردن یک الگوی تکرار پذیر .
اضافه کردن مراحل آماده سازی نمونه می تواند کیفیت نتیجه نهایی را بهتر کند ، اما این امر به قیمت از دست دادن گروهی از پروتئین ها تمام می شود . به هر حال ، این تناقض و نسبت معکوس بین کیفیت نمونه بهبود یافته و نمونه سازی کامل پروتئین ها باید کاملا در نظر گرفته شود .
در هر صورت ، خطوط راهنمای کلی ،برای آماده سازی نمونه وجود دارد که با پیگیری آنها می توان قدمهای نخست را در این راه به درستی برداشت و سپس با تجربه بهترین نمونه را بدست آورد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
برای اینکه بدانیم یک نمونه استخراج شده ، از چه تعداد پروتئین تشکیل شده است و بتوانیم پروتئین ها را مورد بررسی قرار دهیم ، از این روش استفاده می کنیم . در حقیقت با این روش نقشه پروتئینی یک نمونه را به دست می آوریم . همان گونه که می دانیم یک موجود زنده در شرایط متفاوت ، رفتار های متفاوتی را از خود نشان می دهد ، تا خود را با آن شرایط تطبیق دهد . مثلا تغییر در محیط کشت یک باکتری ، از نظر رژیم غذایی ، باعث ترشح آنزیم های متفاوتی می شود . اگر در محیط کشت نشاسته وجود داشته باشد ، باکتری آنزیمی را ترشح می کند ، که بتواند آن نشاسته را هضم کند . اگر در محیط کشت باکتری از چربی یا پروتئین استفاده شود ، باکتری آنزیمی ترشح می کند که بتواند آنها را هضم کند . پس تغییر در محیط کشت از نظر رژیم غذایی ، باعث تغییر کمی و کیفی در پروتئین های باکتری و به دنبال آن تغییر در نقشه پروتئوم آن باکتری می شود . همینطور تغییرات فیزیکی و شیمیایی در پیرامون باکتری ، سبب تغییرات در نقشه پروتئوم باکتری می شود . در سایر موجودات نیز این تغییرات ثبت شده اند . مثلا آنزیم پراکسیداز در ترب سیاه سالم و ترب سیاه ضخمی شده از نظر مقدار تفاوت دارد . این تغییرات را می توان با روش الکتروفورز 2 بعدی مشخص نمود.
در این روش پروتئین ها در محور X توسط میدان الکتریکی و اختلاف در PI آنها جدا می شوند . سپس در محور Y بر اساس تفاوت در جرم مولکولی جداسازی می شوند. به این ترتیب یک نقشه پروتئینی برای یک نمونه تشکیل می شود .
نویسنده : ابوذر عسکری
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)