اثر حجم نمونه تزریقی بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
به ترتیب از آبی به قرمز حجم نمونه تزریقی به ستون ژل فیلتراسیون اضافه می شود .
حجم تزریقی نمونه به ستون کروماتوگرافی به روش ژل فیلتراسیون 2 الی 5 درصد حجم ژل می باشد . 2 درصد ایده آل و 5 درصد قابل قبول است . بدیهی است که در صورت افزایش این درصد کیفیت و رزولیشن گراف پایین می آید . همان طور که مشخص است در گراف قرمز ، پیک ها شارپ نیست ، یعنی عرض آنها زیاد است و مقدار جذب کمتری را در قله می بینیم . این امر باعث می شود که رزولیشن کمتری داشته باشیم.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
سرعت ، در جداسازی پروتئینهای یک نمونه تأثیر دارد ، در حقیقت کاهش سرعت فاز متحرک رزولیشن (Resolution) کروماتوگرافی را زیاد می کند ، همچنین باعث شارپ شدن پیک ها می شود . همانگونه که در گراف نارنجی مشخص است ، رزولیشن و ارتفاع پیک ها بیشتر است .
در این نمونه 7 نوع پروتئین وجود دارد ، گراف های بالا بر حسب (جذب پر حجم) (Abs/V) ولی گراف پایین بر حسب (Abs/min) است .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
یکی از مراحل ، برای تخلیص پروتئینها و همچنین شناسایی آنها ، که حتما باید مورد توجه قرار گیرد ، این است که باید نمونه را تا حد امکان عاری از یونهای مزاحم کرد . مراحلی نظیر الکتروفورز و یا نمونه آماده شده برای لود کردن در ستونهای کروماتوگرافی . این روش را که برای حذف یونهای مزاحم از نمونه انجام می گیرد ، دیالیز می نامند . همچنین می توان با کمک دیالیز محیط نمونه را حاوی یونهای دلخواه کرد . دیالیز در آزمایشگاه پروتئومیکس به وسیله کیسه دیالیز انجام می گیرد . این کیسه غشائی است نیمه تراوا ، که یونها به راحتی از میان جداره آن عبور می کنند ، ولی مولکولهای بزرگی مثل پروتئین ها قابلیت عبور از این جداره را نداشته ، درون کیسه باقی می مانند . جریان حرکت یون ها در دیالیز طبق قانون انتشار صورت می گیرد . همیشه یونها از جایی که غلظت آنها فراوان است ، به سمت جایی که غلظت آنها کم است در حرکتند . این حرکت مستقل از حرکت سایر یونها می باشد و هر نوع یون مستقل از یونهای دیگر ، همیشه از جایی که تعداد آنها بیشتر است ، به جایی که تعدادشان کمتر است حرکت می کنند . ممکن است این فراوانی در داخل باشد . در این صورت جریان حرکت از داخل به سمت بیرون است . همچنین ممکن است این فراوانی در خارج از کیسه باشد . پس نتیجه آن حرکت یونها از خارج به سمت داخل خواهد بود . در هنگام دیالیز ممکن است ، انواعی از یونها به داخل آمده و همزمان انواع دیگری از آنها ، به خارج بروند . این حرکت تا جایی ادامه پیدا می کند ، که غلظت هر نوع از یونها در داخل و خارج کیسه دیالیز برابر شود (به تعادل غلظتی برسند) .دیالیز با تعویض بافر ادامه پیدا می کند . دوباره یونها با حرکت خود و عبور از جداره کیسه ، باعث تعادلی دیگر می شوند .
2 عامل مقدار بافر و تعداد تعویض بافر در دیالیز نقش دارند . مقدار بافر به حجم نمونه بستگی دارد . اما تعداد تعویض بافر هر چه بیشتر باشد ، بهتر است .معمولا این تعداد کمتر از 3 بار نیست .
بعد از آماده سازی کیسه دیالیز و بستن انتهای آن با گیره مخصوص و یا با نخی کلفت (که باعث پارگی کیسه نشود) ، نمونه را در کیسه ریخته و ورودی آن را هم در صورت لزوم می بندند(در بعضی از موارد می توان ورودی را نبست ). کیسه را در بافر مورد نظر به صورت معلق و آویزان در آورده ، در صورت امکان یک مگنت در ظرف بافر انداخته و ظرف را روی همزن مغناطیسی قرار می دهند تا سرعت تبادل یونها بیشتر شود .
روش صحیح بستن انتها و ابتدای کیسه دیالیز :
بهترین روش همان گیره مخصوص کیسه دیالیز است . دو سطح کیسه (کیسه دیالیز در دو طرف خود 2 اثر تا خوردگی دارد) را دقیقا روی هم قرار می دهیم ، طوری که چروک نباشد . کیسه را از حدود یک الی دو سانتیمتری آخر آن ، یک تا زده و طوری که هنوز کیسه چروک نشده باشد ، گیره را در همین قسمت گذاشته و آن را می بندیم . در صورت نبود گیره می توان از نخی کلفت استفاده کرد .
ابتدای کیسه را هم می توان به 2 روش بالا و به همین ترتیب بست . اما در خیلی از موارد می توان این کار را نکرد . به شرط آنکه سر کیسه دیالیز را بالای سطح بافر قرار دهید و مطمئن باشید که بافر از آن وارد کیسه نمی شود . در این حالت ممکن است کمی (بسیار کم) تغییر حجم داشته باشید . ( در صورت تفاوت خیلی زیاد در غلظت نمونه و بافر) . زیرا مولکولهای آب نیز طبق قانون انتشار دوست دارند از جایی که غلظت آن زیاد است ، به جایی که غلظت آن کم است ، حرکت کنند . در حقیقت نمونه ، که دارای غلظتی از یونها می باشد ، از لحاظ غلظتی آب کمتری دارد نسبت به بافر که فاقد یون است . این امر باعث جابجایی جزئی آب از بافر به سمت نمونه می گردد . هر چند این تفاوت بسیار اندک است ، اما تأثیر گذار است .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
