اقایون حذف عکسها توسط سرور است , ایراد از بنده نیست .
می خوام به زبون عامیانه یه کم درد و دل کنم برای شما دوستان .
به خدا قسم خسته شدم که هی این وبلاگو در 4 سرور مختلف ف ی ل تر کردند و یا عکسهاشو حذف کردند و هی من مطالب رو به یه سرور جدید با ادرس جدید بردم و یا هی عکسها رو آپلود کردم .
به امید فتح قله های علم با همین وضعیت!!!
راستش اگر چند وقتیه دیگه مطلب نمی دم به خاطر همین خستگیهاست . ولی بدونید پاسخگوی شما محققین هستم .
اما یک گله هم بکنم از دوستانی که بدون کوچکترین تحقیق ,تأکید می کنم بدون کوچکترین تحقیق و حاضر و آماده از من مطلب میخوان و فقط به فکر این هستن که پایان نامشونو یه جوری , سر و تهشو بهم بیارند , اونم چند روز مونده به امتحانشون و یا دفاعشون !
با تشکر از صبر و حوصله شما
ابوذر عسکری
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
چندی است که به علت درگیری فراوان وقت نمی کنم وبلاگ را آپ کنم . اما هر چند روز یک بار به نظرات و مشکلات شما عزیزان رسیدگی خواهم کرد و چنانچه پاسخ و یا راهکاری داشته باشم ، پاسخگو خواهم بود .
به امید موفقیت برای شما عزیزان
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 15 شهريور 1390برچسب:,
در ساعت12:18 | |
مشکلات بر سر راه تحقیقات
1- آنچه مسلم است ، فقط دانش فنی در ارائه و رشد تحقیقات کافی نیست . به نظر شما (محققین دلسوز) ، چه مشکلاتی بر سر راه تحقیقات ، برای شما وجود دارد ؟؟
2- چگونه می توان تحقیقات را ، به تولید و ثروت ملی تبدیل کرد؟؟
جواب خود را در قسمت نظرات برای ما ارسال نمایید.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
متأسفانه در مملکت ما هنوز مشکل اشتباه در فیلترینگ ، کما فی السابق حل نشده باقی مانده است . همانطور که می دانید ، عکسهای این وبلاگ ، بدون هیچ اخطار یا اطلاعیه ای ، توسط مدیریت سرور حذف شده بود . که در این هفته این عکسها و نمودار ها را آپ خواهم کرد . به هر حال باید 90 درصد مردم ، به پای 10 درصد از مردم بسوزند و این امر در مملکت ما ، یک قانون شده است .
ای مسلمانان :
خداوند با آن وجود کبریاییش ، هیچ انسانی را به هیچ کاری مجبور نمی کند و انسان را موجودی مختار آفریده است .
نکند که عده ای کاسه داغ تر از آش شوند .
تا کی باید وب سایتها و وبلاگهای مفید فیلتر و یا حذف شوند؟؟؟
یکی از مخالفین قانون فیلترینگ
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در یک شنبه 11 ارديبهشت 1390برچسب:,
در ساعت12:23 | |
ایراد در سرویس دهنده این وبلاگ
با سلام به دوستان عزیزم
متأسفانه چندی است که سرویس دهنده وبلاگم ، سرویس مناسب ارائه نمی دهد . ایراداتی نظیر عدم مشاهده عکسها و موارد دیگر نظیر آمار و غیره . بعد از تماس با این سرویس ، حتی جواب هم به ما داده نشد . متأسفانه قبلا بنده 4 بار سرویس ارائه دهنده خود را عوض کرده ام ، اما همچنان این مشکلات وجود دارد . نمی دانم به چه سرویسی اعتماد کنم .
در بلاگر هم این مشکل وجود داشت و عکسهایم را نشان نمی داد . اگر کسی این مشکل را می تواند حل کند ، مرا بسیار خوشحال می کند .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در جمعه 2 ارديبهشت 1390برچسب:,
در ساعت16:46 | |
تبریک به مناسبت فرارسیدن سال 1390
>>> این عید باستانی را پیشاپیش به شما عزیزان تبریک عرض می نمایم <<<
>>> امیدوارم همیشه سرافراز و سربلند باشید <<<
>>> و همیشه فرد تأثیر گذاری باشید <<<
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در چهار شنبه 29 اسفند 1389برچسب:,
در ساعت12:14 | |
سنجش پروتئین ها (بخش دوم ، بیسین چونینیک ، برادفورد)
سنجش پروتئین ها (بخش دوم ، بیسین چونینیک ، برادفورد)
تعیین کمی پروتئین ها
·به طور کلی یک متد رضایت بخش و کامل برای تعیین غلظت هیچ نمونه پروتئینی وجود ندارد .
·انتخاب یک متد ، وابسته به نوع و ماهیت پروتئین ، ماهیت سایر ترکیبات نمونه پروتئینی ، سرعت مورد لزوم ، دقت و حساسیت تست است .
متدهای مورد استفاده برای تعیین پروتئینها
·Biuret Test بیوره
·لوری Folin-Ciocalteu ( Lowry ) Assay
·بیسین چونینیک Bicinchoninic Acid ( BCA ) Assay
·برادفورد Dye-Binding ( Bradford ) Assay
·اولترا ویولت Ultraviolet Absorbance
در ادامه مطلب مي خوانيد ،
تست بيسين چونينيك (BCA) ، تست برادفورد (Bradford)
.ادامه مطلب برای عموم آزاد است
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
·به طور کلی یک متد رضایت بخش و کامل برای تعیین غلظت هیچ نمونه پروتئینی وجود ندارد .
·انتخاب یک متد ، وابسته به نوع و ماهیت پروتئین ، ماهیت سایر ترکیبات نمونه پروتئینی ، سرعت مورد لزوم ، دقت و حساسیت تست است .
متدهای مورد استفاده برای تعیین پروتئینها
·Biuret Test بیوره
·لوری Folin-Ciocalteu ( Lowry ) Assay
·بیسین چونینیک Bicinchoninic Acid ( BCA ) Assay
·برادفورد Dye-Binding ( Bradford ) Assay
·اولترا ویولت Ultraviolet Absorbance
تست بیوره (Biuret)
•Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.
•Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.
•Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940.
•Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology.Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269.
•Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.
ویژگیهای تست بیوره (Biuret) · تکرار پذیر
· عوامل تداخل کننده بسیار زیاد (به عنوان مثال نمک آمونیوم )
· انحراف کم نسبت به متدهای لوری یا اولترا ویولت
· احتیاج به مقدار زیاد پروتئین (1-20mg)
· حساسیت کم
تست بیوره (Biuret)
1- 15 دقیقه قبل از استفاده ، اسپکتوفوتومتر را روشن شود.
2- نمونه ها با بافر رقیق شود . به صورت تقریبی 1-10mg/ml . به هر لوله تست 1ml نمونه اضافه شود . روش دوبلیکیت مورد لزوم است.
3- یک لوله حاوی 1ml بافر برای مرجع یا بلنک تهیه شود .
4- BSA با غلظت 10mg/ml تهیه کرده و استاندارهای 1 تا 10mg/ml از آن ساخته شود .
5- به هر لوله 9ml واکنشگر بیوره ریخته ، بلافاصله ورتکس شده ، اجازه دهید 20 دقیقه بماند .
6- در طول موج 550nm خوانده شود .
تست لوری (Lowry)
•Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951.
•Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978.
•Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
•Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).
ویژگیهای تست لوری (Lowry)
· حساسیت در سرتاسر رنج آن
· قابل استفاده در دمای اتاق
· قابل استفاده در مقیاس میکرو پلیت
· 10-20 مرتبه حساستر از UV detection
· بسیاری از مواد در تست تداخل ایجاد می کنند . (اسیدهای قوی ، آمونیوم سولفات)
· زمان قابل توجهی را می طلبد
· این تست نسبت به نور حساس است ، لذا در طول انجام آن باید از نور دور باشد .
· میزان رنگ با پروتئین های مختلف ، تغییر می کند
تست لوری (Lowry)
1- نمونه ها که شامل 100 µg پروتئین است اضافه شود .
2- همه لوله ها با آب به حجم 1ml رسانده شود .
3- محلول تست آماده و معرف فولین رقیق شود .
4- در هر لوله 5ml معرف تست ریخته و کاملا ورتکس شود .
5- لوله ها به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبیت شود .
6- به هر لوله 0.5ml محلول رقیق شده فولین اضافه شود .
7- در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبیت شود .
8- لوله ها ورتکس شده .اسپکتوفوتومتر با بلنک صفر شده ، جذب آن را در 500-750nm خوانده شود .
Xin Li
Scott Group
05/10/2005
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
برای بررسی نمونه ای که دارای رنج وسیعی از جرم های مولکولی متفاوت است , باید از ژلی که دارای منافذی با اندازه های متفاوت است (شیب منافذ) , استفاده کرد . در این ژل منافذ در بالای ژل بزرگ تر از منافذ پایین ژل است . در حین پیشرفت کار حرکت پروتئین ها بیشتر محدود می شود . در حضور یک ژل گرادیانت رنج وسیعی از جداسازی حاصل می شود و نسبت به یک ژل با غلظت یکسان , باندها بهتر نگه داشته می شوند .
تهیه ژل گرادیانت : ژلهای گرادیانت اگر چه از ژلهای با غلظت ثابت مشکل تر ریخته می شوند , اما رنج پهناوری از پروتئین ها را جدا سازی می کنند . بعلاوه اینکه محاسبه وزن مولکولی آنها خیلی ساده تر است , زیرا برخلاف ژلهایی که غلظت ثابت دارند , ارتباط بین Log اندازه مولکولها و میزان حرکت آنها در سرتاسر رنج جداسازی روی ژل , خطی است .
مواد و تجهیزات :
محلول ژل
ساکاروز (Sucrose)
گرادیانت میکر
پمپ پیریستالتیک با توانایی 1.6ml/min
لوله مخصوص پمپ
بهم زن مغناطیسی
یک دستگاه الکتروفورز , همراه صفحات شیشه ای و اسپیسرها و شانه مخصوص .
جایگاه ریختن ژل
منبع الکتریسیته
دستورالعمل :
1- جایگاه ریخته شدن ژل را نصب نمایید .
2- لوله پمپ را به محل اتصال خروجی گرادیانت میکر وصل کنید . سر دیگر آن را به پمپ متصل کنید . طول مدت ریخته گری ژل 5- 10min طول خواهد کشید . لوله دیگر را از پمپ به جایگاه ریخته شدن ژل وصل نمایید .
3- دو نوع محلول با غلظت های کم و زیاد را که در داخل مخزن های گرادیانت میکر ریخته خواهند شد , طبق جدول درست نمایید . این محلول ها دارای آمونیوم پرسولفات است ولی از ریختن TEMED در آنها خود داری نمایید . ژلهای 5-20% و یا 10-20% ژلهای مطلوبی هستند . هواگیری در این پروتوکل لازم نیست . محلول ها را میکس نمایید . محلول غلیظ تر را برای جلوگیری از پلیمریزاسیون در محیط یخ یا آب سرد قرار دهید . محلول غلیظ آکریل آمید ممکن است بدون حضور TEMED و فقط با آمونیوم پرسولفات اضافه شده , پلیمره شود .
4- TEMED را به آرامی به محلول درون مخزنها که در حال میکس شدن است , اضافه کنید . توجه کنید که اول محلول ژل را به گرادیانت میکر اضافه نمایید ( بدون اضافه کردن TEMED ) . فقط قبل از باز کردن شیر خروجی به ازای هر میلی لیتر 33 میکرو لیتر TEMED به محلول اضافه نمایید .
5- محلول غلیظ تر در مخزنی که میکسر دارد و خروجی آن به ژل متصل است , ریخته می شود . در هنگام پر کردن محفظه ژل , محلول غلیظ تر زود تر از همه وارد محفظه ژل می شود . وقتی که محلول غلیظ تر وارد محفظه ژل می شود , به ته آن می رود . محلول رقیق تر به مخزنی که همزن دارد , وارد می شود و بدین ترتیب محلول غلیظ کمی رقیق تر می شود .
6- شیر را باز کنید , تا این عمل انجام شود .سپس ببندید .
7- محلول رقیق وارد مخزن دارای میکسر می شود .
8- محلول در این مخزن میکس می شود .
9- شیر خروجی و پمپ را روشن کنید .
10-وقتی که شلنگ در حدود چند میلی لیتر از محلول غلیظ پر شد , شیر میان دو مخزن را باز کنید . پمپ تا زمانی که محفظه ژل پر شود , روشن باقی می ماند .
11-روی سطح ژل را با 0.3ml آب اشباع شده با n-butanol بپوشانید و صبر کنید تا پلیمریزاسیون انجام شود . سپس ژل بالا (stacking gel)را بریزید .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
طیف جرمی به صورت نموداری از درصد فراوانی یون بر حسب نسبت m/e نشان داده می شود . فراوان ترین یون تشکیل شده در محفظه یونیزاسیون بلندترین قله را در طیف جرمی تشکیل می دهد . این قله را قله مادر (Base Peak) می نامند .
جدا کردن یک الکترون از یک مولکول ، یونی را ایجاد می کند که وزن آن ، وزن مولکولی واقعی اولیه است . این یون ، یون مولکول (Molecular Ion) است .
مقدار m/e که در آن یون مولکول [M+] بر روی طیف ظاهر می شود ( با فرض اینکه آن یون فقط فاقد یک الکترون باشد ) دارای وزن مولکولی مولکول اولیه است . یون مولکول در واقع یک کاتیون- رادیکال است . بسیار از اوقات ایزوتوپها در یک یا دو واحد جرمی بیش از جرم اتم معمولی ظاهر می گردند . بنابر این علاوه بر کاوش قله یون مولکول[M+] ، تلاش می شود قلل [M+1] ، [M+2] و ... نیز یافت شوند . گاهی از روی الگوی این ناحیه از طیف جرمی می توان ، نوع عناصری مانند هالوژنها و تعداد آنها را یافت .
یونهایی که طول عمر آنها بیش از 10-6 ثانیه باشد ، قبل از اینکه فرصت جزء به جزء شدن بیابند ، در محفظه یونیزاسیون شتاب داده می شوند . در حین عبور از محفظه تجزیه گر طیف سنج جرمی این اجزاء خرد شده و قطعات یونی جدیدی تولید می کنند ، که انرژی آنها به مراتب کمتر از یونهای معمولی است . چون بخش بدون بار بخشی از انرژی را به همراه خود می رباید . قطعه یونی تشکیل شده دارای نسبت m/e خاصی است که بستگی به جرم جزء اولیه و جزء جدید تشکیل شده دارد . این یون را قله یون پایدارنما(Meta Stable Ion Peak) نشان می دهد . m/eاین جزء یونی تشکیل شده معمولا عددی غیر صحیح است و جرم آن m* از رابطه زیر به دست می آید .
m*= m2 / m1
که m1 = جرم یون اولیه و m2 = جرم قطعه یونی جدید می باشد .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
هنوز مشكل لب تابم حل نشده است و سرعت اينترنت هم مزيد بر علت شده است كه مطلبي را ارسال نمايم ، اما اين پست را فرستادم تا به شما بگويم كه ، به يادتان هستم . به زودي با مطالب جديد مهمان شما خواهم بود .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در پنج شنبه 21 بهمن 1389برچسب:,
در ساعت8:37 | |
آماده سازی و ساخت ژل IEF
آماده سازی ژل IEF
جدیدا به جای استفاده از آمفولایت ها که عدم تکرار پذیری و مشکلات زیادی دارند ، IPG ها بر اساس استفاده از معرفهای ایموبلاین Immobiline تهیه می شوند .ایموبلاینها مشتقات ده گانه ای از کربن آمید هستند که ساختار پایه ای یکسانی دارند (PH=1-12) . بافرهای ایموبلاین دسته مولکولهای شناخته شده ای هستند که هر یک دارای یک گروه بافر کننده اسیدی یا بازی متصل به یک مونومر کربن آمید هستند . از آنجایی که انتهای واکنش دهنده مولکول با ماتریکس آکریل آمید پلیمره می شود ، ایموبلاین های بافر کننده در حین پلیمریزاسیون ایجاد شیب PH می کنند ، که بطور کووالانت از طریق باندهای وینیل به شبکه پلی آکریل آمید متصل می شوند .
روشهایی برای آماده سازی دستی این ژلها وجود دارد ، که البته اکنون از این روشها به ندرت استفاده می شود و بیشتر نوارهای IPG آماده ، مورد مصرف قرار می گیرند . در روشهای دستی ، ژلهای تخت IPG تا محدوده PH مورد نظر بر روی ورقه های شفاف Gel Bound Tagged Films ریخته می شوند که ژل پلی آکریل آمید به خوبی به آنها متصل می شود . ژل ها پس از پلیمریزه شدن ، کاملا با آب دیونیزه شده ، شسته می شوند . یعنی 6 بار و هر بار به مدت 10 دقیقه در آب دیونیزه و بعد در گلیسرول 2% به مدت 30 دقیقه غوطه ور می شوند و سپس در دمای اتاق در نقطه ای که عاری از هر گونه گرد و غباری باشد ، قرار داده می شوند تا خشک گردند و روی آنها با ورقه ای پوشیده می شود . در صورت عدم تمایل به استفاده سریع از آنها ، می توان آنها را برای مدت یک سال در 20- درجه سانتیگراد نگهداری کرد . قبل از استفاده ژلها به میزان لازم برش داده می شوند . همانطور که ذکر شد نوارهای IPG از پیش آماده ، در بازار موجود هستند . این نوارها در طولهای متفاوت بوده و هر چه میزان طول نوارها بلندتر باشد ، تعداد پروتئین هایی که می توانند از هم تفکیک گردند بیشتر خواهد بود . نوارهای 18 یا 24 سانتیمتری معمولا برای جداسازی با قدرت تفکیک بالا استفاده می شوند ، در حالیکه نوارهای 7 یا 11 سانتیمتری برای غربالگری سریع نمونه ها مورد استفاده قرار می گیرند .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در روشهای آماده سازی نمونه ، رسوب دادن پروتئین ها به عنوان یک مرحله اختیاری تلقی می گردد . این روش برای جدا کردن انتخابی پروتئین ها از مواد آلاینده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها ، دترجنت ها ، اسیدهای نوکلئیک ، و غیره به کار گرفته می شود . از این روش برای تغلیظ پروتئین های موجود در یک نمونه که در حالت عادی بسیار رقیق باشند ، نیز استفاده می شود .
باید توجه داشت که هیچ روش رسوب دهی به طور کامل کارامد نیست و برخی از پروتئین ها بعد از رسوب داده شدن ، مجددا محلول نمی شوند . به همین دلیل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی استفاده کردن از این روش را در دستور کار می توان قرار داد . در صورتیکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترین نمایه دو بعدی یک نمونه باشد ، باید از انجام رسوبدهی صرف نظر کرد .
جزء به جزء کردن نمونه(Fractionation)
پروتئین هایی که در بافتهای اوکاریوتی بیان می شوند ، از گوناگونی بسیاری برخوردار بوده ، و دارای محدوده دینامیک (محدوده غلظت پروتئین های داخل یک نمونه بین کمترین تا بیشترین غلظت(Range Dynamic) ) وسیعی هستند . برخی از مواقع در نمونه هایی این چنین ، به منظور کاهش پیچیدگی نمونه و افزایش تعداد پروتئین هایی که دارای نسخه پایین هستند ، نمونه جزء به جزء می شود . می توان از روشهای متفاوتی مانند جزء به جزء کردن اجزاء سلولی (Sub-Cellular Fractionation) ، الکتروفورز در فاز مایع ، کروماتوگرافی جذبی و رسوبدهی انتخابی بهره برد . استخراج پی در پی (Sequential Extraction) پروتئین ها از یک سلول یا بافت بر اساس حلالیت آنها در دسته ای از بافر ها که قدرت و خاصیت محلول سازی آنها به تدریج افزایش پیدا می کند ، روش دیگری از جزء به جزء کردن است .
زمانی که قسمتی از پروتئین های سلول یا بافت مورد نظر باشد ، می توان در حین آماده سازی ، نمونه را نیز جزء به جزء کرد . اگر پروتئین هایی از یک قسمت زیر سلولی خاص مورد نظر باشند ، برای مثال ریبوزوم ها ، می توان ارگانل مورد نظر را توسط سانتریفوژ کردن تمایزی در شیبهای سوکروز جدا نمود . اگر چه این روشها را می توان در سلولهای پستانداران که معمولا دارای جداره سلولی ضعیفی هستند ، نیز به کار برد ، اما دسترسی به اورگانل ها در میکرواورگانیسم های دیگر بسیار مشکل است ، زیرا یک روش لیز کردن برای شکستن کارامد دیواره سلولی مورد نیاز است که در عین حال نباید آنقدر خشن باشد که باعث از بین رفتن ارگانل و تخریب آن شود .
رسوبدهی انتخابی بعضی از کلاسهای پروتئینی توسط استن-TCA صورت می گیرد . دیگر روش ، روشهای عصاره گیری متوالی با بافرهایی که به تدریج قدرت محلول سازی آنها افزایش می یابد ، است . مثلا بافرهای مائی ، حلالهای آلی نظیر اتانول ، کلروفورم و اتانول و محلول های حاوی دترجنتهای مختلف . بالاخره روشهای جداسازی کروماتوگرافی ، الکتروفورز در فاز مائی نیز در جزء به جزء کردن نمونه ها بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی متفاوت پروتئینهای موجود در نمونه قابل انجام هستند . تصمیم در انتخاب هر یک از این روشها بستگی به ماهیت نمونه و هدف از کار با نمونه دارد .
روشهای جزء به جزء کردن ، ممکن است مزایای بسیاری در غنی سازی پروتئین ها داشته باشند ، اما اصلی ترین نکته منفی در استفاده از این روشها ، این است که بسیار زمانگیر و بسیار پیچیده اند . همچنین نمی توان در یک زمان چند نمونه را وارد این مرحله از کار نمود . اما مزیت اصلی آن ،تعیین جایگاه پروتئین ها از نظر ساختمانی در زیر ساختار سلولی و تعیین عملکرد آنها است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
دوستان عزیز ، با توجه به مشکلات سخت افزاری که برای لب تاب بنده پیش آمده و اینکه بیشتر مطالب را در همین لب تاب آماده می کردم ، ممکن است در آپ کردن مطالب تأخیر بوجود آید . لذا از همه دوستان عزیز در همینجا معذرت می خواهم و تا رفع مشکل شکیبا باشند .
2 مطلب دیگر هم اضافه کنم .
یکی اینکه وبلاگ با سرعت کمی بالا می آید و از شما درخواست دارم ، کمی شکیباتر باشید .
دوم اینکه با امتیاز دادن به مطالب ، ما را در انتخاب مطالب کمک نمایید ، تا آن مطالبی که بیشتر مورد توجه دوستان است ، در وبلاگ بیاوریم . در پایین مطالب این وبلاگ یک آیکون 5 ستاره ای است ، که به تعداد مورد نظر شما قرمز رنگ می شود و با یک کلید کار تمام است ، این کار بدون صرف هیچ زمانی انجام می شود .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در پنج شنبه 7 بهمن 1389برچسب:,
در ساعت6:14 | |
روشهای خارج کردن ترکیبات تداخل کننده
روشهای خارج کردن ترکیبات تداخل کننده
در حین لیز سلولی و بعد از آن ، ترکیبات تداخل کننده ای نظیر آنزیمهای پروتئولایتیک ، نمکها ، لیپیدها ، اسیدهای نوکلوئیک ، پلی ساکاریدها ، و فنل های گیاهی باید غیر فعال شده یا از نمونه تهیه شده خارج گردند .
در این بخش به توضیح این آلاینده ها و اثر آنها بر الکتروفورز 2 بعدی پرداخته و روشهای حذف آنها را شرح خواهیم داد .
پروتئازها
پروتئازهای موجود و حاضر در نمونه باید غیر فعال شوند تا از تخریب پروتئین ها جلو گیری شود . در غیر این صورت پروتئازها با شکستن پروتئین ها سبب پدیدار شدن نقاط مصنوعی در نمایه 2 بعدی می شوند . روشهای مختلفی برای مقابله با پروتئولیز ضمن آماده سازی نمونه وجود دارد . برای مثال استخراج پروتئین در PH بازی ، جوشاندن نمونه در SDS و همچنین استفاده از مهار کننده های پروتئازها (PI) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر .
مهار کننده های پروتئاز را می توان به محلول لیز کننده افزود ، اما همیشه این کار توصیه نمی شود . چرا که این مواد ممکن است باعث ایجاد تغییر بار الکتریکی در پروتئین های دیگر شده و سبب ایجاد نقاط مصنوعی شوند . راه حل های دیگر جوشاندن نمونه در بافری با PH بالا نظیر بافر تریس است که دارای SDS باشند . برای غیر فعال کردن پروتئاز ها با PH پایین از رسوب دادن با TCA 20% بر روی یخ می توان بهره برد .
این نکته را باید در نظر داشت که غیر فعال سازی کامل تمام پروتئازها کاری بسیار سخت است . رسوب دهی توسط TCA و استن در کاهش تخریب پروتئین ها و خارج ساختن ترکیبات تداخل کننده معمولا مفید است . اما باید کاملا مراقب بود که پروتئین ها در اثر رسوب دادن ناقص و یا بعد از رسوب دادن ، در حین محلول کردن دوباره ، از دست نروند . نشان داده شده است که محلول های حاوی تیواوره 2 مولار و اوره 7 مولار کارآیی قابل توجهی در مهار کردن پروتئازهای نمونه دارند . تیواوره علاوه بر مفید بودن در حل کردن پروتئین ها به عنوان یک مهار کننده قوی پروتئازها نیز عمل می کند .
اسیدهای نوکلوئیک
حضور اسیدهای نوکلوئیک نیز می تواند در حین IEF مسئله ساز شود . این امر ناشی از افزایش در ویسکوزیته نمونه و در بعضی از موارد ایجاد کمپلکس هایی با پروتئین ها ی نمونه است که منجر به مهاجرت غیر عادی و ایجاد رگه های افقی و عمودی در نمایه ژل الکتروفورز 2 بعدی می شود . اگر مشکلاتی از این قبیل بوجود آید بهترین کار متلاشی کردن اسید نوکلوئیک با یک اندونوکلوئاز خالص و مناسب و عاری از پروتئاز است . روش دیگر استفاده از توانایی آمفولیت ها در ایجاد کمپلکس با اسیدهای نوکلوئیک و بعد خارج کردن این کمپلکس ها با اولترا سانتریفوژ است .
نمک ها
نمکها با تغییر در رسانایی و قدرت عبور جریان الکتریکی در ژلهای IPG باعث اختلال در IEF شده و تا زمانی که یونهای نمک از انتهای نوارهای IPG خارج نشوند فوکوسینگ پروتئین ها اتفاق نخواهد افتاد . همین امر زمان فوکوسینگ را افزایش می دهد . حضور نمک در نمونه ، ممکن است باعث جابجایی آب موجود در نوار IPG نیز شود . به طوریکه یک سمت ژل خشک و سمت دیگر متورم خواهد شد . از طرف دیگر وجود مقادیر زیاد نمک در نمونه باعث می شود پروتئین ها در نواحی نسبتا عریضی در دو انتهای ژل فوکوس نشوند . به همین دلایل نمک اضافی موجود در نمونه ها باید خارج شوند ، یا به کمترین حد ممکن تقلیل یابند . همانطور که قبلا اشاره شده است باید غلظت نمک موجود در نمونه کمتر از 40 میلی مولار باشد . زمانیکه نمونه در حین خیساندن ژل بار گیری می شود ، باید غلظت نمک کمتر از 10 میلی مولار باشد .
برای نمک زدایی از روشهای مختلفی می توان استفاده کرد ، که رایج ترین آنها استفاده از دیالیز ، تغلیظ کننده های غشائی ، ژل فیلتراسیون و رسوب دهی است . دیالیز روشی بسیار کارامد است ، که در آن کمترین مقدار از نمونه از دست داده می شود . اما دارای روندی طولانی مدت است و احتیاج به حجم بالایی از محلول دارد . تغلیظ کننده ها ی غشایی یا دیالیز همراه با سانتریفوژ روش سریع تری هستند . اما امکان اتصال پروتئین ها با غشاء دیالیز در این روش بیشتر است . در ژل فیلتراسیون نیز امکان از دست رفتن پروتئین های نمونه زیاد است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (حامل های آمفولیتی)
حامل های آمفولیتی
حاملهای آمفولایتی با به حداقل رساندن پدیده توده شدن پروتئین ها از طریق ایجاد برهمکنش های ناشی از بارهای الکتریکی موجود بر روی پروتئین ها باعث افزایش حل پذیری آنها می شوند .
یکی از اساسی ترین چالش های IEF تمایل زیاد برخی پروتئین ها به رسوب در نقطه ایزوالکتریکشان است . در برخی از نمونه ها پروتئین هایی وجود دارند که برای حفظ حلالیتشان ، حتی در حضور دترجنت ها ، نیاز به وجود نمک دارند . این امر مشکل ساز است ، زیرا هر گونه نمکی که در محلول وجود داشته باشد ، در حین جریان بالایی که در ابتدای IEF اعمال می شود از ژل خارج می شود . بدین ترتیب پروتئین هایی که برای حلالیت خود نیاز به نمک دارند ، با خارج شدن آن رسوب می کنند . از طرفی دیگر ، وجود نمک باعث محدود کردن ولتاژی می گردد که می توان بدون ایجاد جریان بسیار بالا به آن دست یافت ، و این امر سبب افزایش زمان فوکوسینگ خواهد شد . نمک تنها در صورتی باید در یک نمونه حضور داشته باشد که نیاز اساسی به حضور آن باشد و در این صورت تنها غلظت کمتر از 40 میلی مولار قابل قبول است . حامل های آمفولیتی برای جبران از دست رفتن نمک در این نمونه ها عمل می کنند . این حامل ها معمولا در غلظتی کمتر از 0.2% به کار گرفته می شوند ، چرا که در غلظت های زیاد ، تا زمانی که در نقطه ایزوالکتریک خود فوکوس شوند ، سبب کاهش سرعت IEF می شوند ، چرا که حامل جریان می باشند و این امر سبب محدود شدن ولتاژ می گردد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در روند تخلیص ، خلوص ، مقدار ، حفظ اکتیویتی پروتئین و اقتصادی بودن شرایط مالی و زمانی بسیار مهم است . خلوص مورد نیاز باید از بررسی نوع منابع مادی ، تعیین نوع استفاده از فراورده نهایی ، و ایمنی آن تعیین شود . برای مثال اختلاف بین آلودگی هایی که باید از نمونه برداشته شود و آلودگی هایی که می تواند در آن باقی بماند ، مهم است . فاکتورهای دیگری هم هستند که تأثیر گذارند . بازده بالا معمولا یک کلید مهم است . همچنین زمان پروسه با یک Assay آهسته ما را به کمترین بهره وری سوق می دهد . همه اطلاعات ما درباره خصوصیات پروتئین هدف و آلودگی های آن ، به ما در طی روند تخلیص کمک می کند و به ما اجازه می دهد ، سریعترین و راحت ترین تکنیک ها را انتخاب کرده و بهره وری بالایی داشته باشیم و از وضعیتی که ممکن است پروتئین هدف غیرفعال شود ، احتراز کنیم .
ایجاد یک تست Assay سریع و قابل اطمینان و تعیین فعالیت پروتئین ، برای ادامه پیشرفت در روند تخلیص ، ضروری است . ( بازده ، فعالیت بیولوژی ، بازیافت )
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 28 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت8:53 | |
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (عوامل احیاء کننده)
عوامل احیاء کننده
عوامل احیاء کننده گروه تیول برای شکستن پیوندهای دی سولفیدی داخل و بین مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند . معمولا این مرحله از اهمیت زیادی در محلول سازی برخوردار است . به خصوص برای پروتئین های منفک شده از سلولهای اوکاریوتی که نحوه تاخوردگی آنها بر پایه پیوند های دی سولفیدی استوار است .
مرکاپتواتانول در روشهای ابتدایی الکتروفورز 2 بعدی به کار گرفته می شد . اما به خاطر مشکلاتی که داشت امروزه از آن استفاده نمی شود . در واقع قسمتی از مرکاپتواتانول در PH بازی یونیزه می شود و داخل قسمت بازی ژل IEF می گردد و به خاطر قدرت بافر کنندگی موجب تخریب شیب PH در قسمت بازی می شود . اگر چه دی تیو تریتول (DTT) دارای pKa حدود 8 است ، اما به دلیل اینکه در غلظت بسیار کمتری استفاده می شود ، ( معمولا 50mM در مقایسه با 700mM موجود در 5% مرکاپتواتانول ) ، ایجاد مشکل مرکاپتواتانول را نمی کند .
دی تایوترایتول DTT و دی تایو اریتریتول DTE ، (Dithioerythritol) رایجترین عوامل احیا کننده مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها و IEF هستند . این معرف ها در یک واکنش تعادلی اکسیده شده و در عوض باعث احیاء پیوندهای دی سولفیدی می شوند . به همین دلیل معرفهای احیاء کننده در مقادیر اضافی ( حداکثر تا 100 میلی مولار ) مورد استفاده قرار می گیرند .
ساختمان شیمیایی DTE و DTT و واکنش آنها با پروتئین ها
به هر حال معرفهایی نظیر DTT و DTE کمی اسیدی و دارای بار الکتریکی هستند ، به همین دلیل در حین الکتروفوکوسینگ به سمت آند مهاجرت می کنند که این امر می تواند منجر به اکسیداسیون مجدد پروتئین های نمونه ، از دست دادن حلالیت نمونه در حین الکتروفورز و ایجاد رگه های افقی در قسمت بازی ژل شود . مخصوصا زمانی که از شیبهای IPG بازی بر روی بعد اول استفاده می شود . این پدیده مشهود تر است . این مسئله را می توان با قرار دادن یک کاغذ الکترود اضافی که در 20 میلی مولار DTT خیسانده شده است . بر روی کاتد حل کرد . بدین ترتیب جایگزینی DTT داخل ژل که به سمت آند حرکت می کند با DTT که این کاغذ در کاتد آزاد می گردد ، تضمین خواهد شد . روش دیگر برای اجتناب از وقوع این پدیده و حفظ قدرت تفکیک ، عدم انجام فوکوسینگ در زمانهای طولانی است .
فسفاین ها (Phsphines) می توانند جایگزین معرفهای احیاء کننده تیول باشند . معرف احیاء کننده بدون بار الکتریکی نظیر تری بوتیل فسفین Tributhyl phosphine , TBP در تمام طول IEF شرایط احیا را حفظ می کند . بدین ترتیب از ایجاد توده های پروتئینی ناشی از ایجاد مجدد پیوندهای دی سولفیدی ممانعت می نماید . علاوه بر این مزیت دیگر TBP امکان استفاده از آن در IEF با شیب های PH بازی است ، چرا که در این شیبها نیز شرایط احیا کنندگی را حفظ می نمایند . از خصوصیات دیگر فسفین ها عدم واکنش دهی شان با برخی از عوامل آلکیله کننده نظیر آکریل آمید و 4- وینیل پیریدین است . در زمان متعادل سازی می توان از این خاصیت برای طراحی یک مرحله ای احیا و آلکیلاسیون با TBP و آکریل آمید استفاده کرد . باید به این نکته توجه کرد که اسیدهای آیودو استیل و آمین ها با فسفینها واکنش می دهند و اگر در آلکیلاسیون از این مواد استفاده شود باید مراحل احیا و الکیلاسیون به صورت جداگانه صورت پذیرند .
فسفاین ها با زنجیره کوتاه مثل TBP در غلظتهای استوک ، موادی فرار ، سمی ، و به شدت قابل اشتعال هستند . اگر چه استوک های رقیق شده را می توان با امنیت مناسب مورد استفاده قرار داد ، اما مشکل در حمل و نقل استوکهای غلیظ است . در عین حال قیمت TBP در مقایسه با DTT بسیار بیشتر است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (دترجنت ها)
دترجنت ها
دترجنت ها مولکولهای آمفیپاتیک (Amphipathic) هستند . یعنی در ساختا خود هم گروه آب گریز و هم گروه قطبی دارند . این مولکولها دارای گروه قطبی در انتهای یک زنجیره کربنی طویل و آبگریز هستند . به همین دلیل مولکولهای آمفیپاتیک در آب رفتار منحصر به فردی از خود نشان می دهند . گروههای قطبی آنها با مولکولهای آب پیوند هیدروژنی تشکیل می دهند . در حالیکه زنجیره های هیدروکربنی آنها ، با ایجاد بر هم کنشهای آب گریز ، به یکدیگر اتصال می یابند . این ساختار خاص به میسل (Miccelle) موسوم است . دترجنتها به دلیل همین خاصیت آمفیپاتیک خود قادرند ترکیبات هیدروفوب را در آب حل کنند .
در بافر محلول سازی ، دترجنت ها تقویت کننده اثر معرفهای کائوتروپیک هستند . این مواد در ممانعت از ایجاد بر هم کنشهای آب گریز بین گروههای داخلی ، که بر اثر عملکرد معرف های کائوتروپیک در معرض محیط خارجی قرار گرفته اند ، نقش مؤثری در محلول سازی ایفا می کنند . عدم محافظت از این گروههای آب گریز خطر از دست دادن پروتئین ها را به دلیل توده شدن در بر دارد . این مسئله به خصوص در مورد پروتئین های هیدروفوبیک ، نظیر پروتئین های غشائی ، که دارای چندین گروه آی گریز هستند ، بارزتر است .
دترجنتها در محلول ساختن پروتئین های غشائی مانند محیط 2 لایه لیپیدی غشاهای بیولوژیک عمل می کنند . این مواد از قسمت آب گریز خود داخل 2 لایه لیپیدی شده با گروههای آب گریز ایجاد پیوند می کنند . همین امر پخش شدن این گروهها را در محیط آبی از طریق تشکیل میسلهای دترجنتی امکان پذیر می کند .
دترجنت ها بر اساس ماهیت سر قطبی خود به دترجنت های یونی و غیر یونی و دو یونی طبقه بندی می شوند . از این میان فقط دترجنتهایی غیر یونی یا دو یونی اجازه مهاجرت پروتئین ها را در ایزوالکتروفوکوسینگ می دهد . دترجنتهایی مثل SDS با IEF سازگاری ندارند .
از دترجنتهای غیر یونی که در الکتروفورز دو بعدی استفاده می شوند ، NP40 و Triton X-100 در غلظتهای 4 – 0.4% رایجترین ها هستند . دترجنتهای دو یونی از دسته سولفوبتائین ها (Sulfobetaines) نسبت به دترجنتهای غیر یونی ارجحیت دارند . سولفوبتائین ها اولین انتخاب برای انجام IEF هستند و در غلظت های بین 2 – 4% مورد استفاده قرار می گیرند . از سولفوبتائین ها CHAPS و CHAPSO و از مشتقات سولفوبتائین های خطی نظیر SB3-10 و آمیدوسولفوبتائین ASB-14 هستند . برای محلول سازی پروتئین های غشائی گاهی مواقع Triton X-100 به مقدار کم ، 0.5% به یک دترجنت سولفوبتائین اضافه می شود . البته برخی از پروتئین ها برای حل شدن به غلظت بالای 4% از دترجنت ها نیازمندند .
به هر حال SDS رایج ترین دترجنت مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها است . خصوصیات شگفت انگیز SDS در محلول سازی پروتئین ها ناشی از تمایل شدید آن در پیوند با پروتئین هاست ، به طوریکه تقریبا یک مولکول SDS به هر دو اسید آمینه موجود در مولکول پروتئین اتصال می یابد . به این ترتیب به خاطر سر آنیونی SDS ترکیب پروتئین و SDS بیشترین حلالیت در آب را خواهد داشت . از دیگر مزایای استفاده از آن جلوگیری از تشکیل اولیگومرها است . گاهی اوقات اورگانیسم هایی با دیواره سلولی محکم ، قبل از اینکه در بافر محلول سازی لیز شوند ، به مدت 5 دقیقه در SDS 1-2% جوشانده می شوند . در استخراج بسیاری از پروتئین های هیدروفوبیک نیز به درصد بالایی از SDS نیاز است . به هر حال قبل از الکتروفورز ، SDS باید با جایگزینی رقیب در بافر محلول سازی از آن خارج شود . برای این کار در ابتدا نمونه حل شده در SDS با بافر محلول سازی رقیق می شود تا جایگزینی دترجنت های رقیب با SDS صورت پذیرد . برای خارج ساختن SDS ممکن است بعد از محلول سازی ، پروتئین ها توسط روش TCA-Acetone رسوب داده شوند . در صورت استفاده از این روش ممکن است رسوب حاصل مجددا به راحتی قابل حل شدن نباشد . اضافه کردن حجم کمی از سود 0.1 مولار می تواند برای غلبه بر این مشکل بسیار کارامد باشد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (معرفهای کائوتروپیک)
بافرهای محلول سازی
بافرهای محلول سازی ممکن است به تنهایی یا در ترکیب با روشهای دیگر متلاشی سازی سلولی به کار گرفته شوند . برای انجام جداسازی مناسب در بعد اول ، نمونه های پروتئینی باید کاملا غیر توده ای و به صورت محلول باشند . این امر برای تمامی انواع نمونه ها در هر مرحله ای از آماده سازی ضروری است . برای این منظور معمولا ، در ترکیب بافرهای محلول سازی از یک یا دو معرف کائوتروپیک ، دترجنت ، معرف احیا کننده ، و آمفولیت استفاده می شود .
در این قسمت به معرفی این اجزاء و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازی نمونه برای انجام الکتروفورز 2 بعدی می پردازیم .
معرفهای کائوتروپیک
بسیاری از پروتئین ها در اشکال طبیعی (Native) دارای چندین شکل فضایی مختلف هستند و به همین دلیل ممکن است در الکتروفورز 2 بعدی الگوهای پیچیده ای ایجاد کنند . این وضعیت تفسیر نمایه های 2 بعدی را دچار مشکل خواهد کرد . برای ساده تر کردن نمایه دو بعدی و حذف اثر شکل فضایی در ایجاد نقاط متعدد مربوط به یک پروتئین و ایجاد پیکی منفرد از آن ، بر هم زدن شکل طبیعی (Denaturing) توسط معرف ها کائوتروپیک انجام می شود .
اوره بهترین عامل کائوتروپیک در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دو بعدی است ، که معمولا با غلظت 8 مولار استفاده می شود . اوره از 2 طریق مستقیم و غیر مستقیم باعث بر هم زدن شکل طبیعی و باز شدن تا خوردگی (Unfolding) مولکولهای پروتئینی می شود . مولکولهای اوره مستقیما جذب گروههای آبدوست (Hydrophill) و قطبی در سطح پروتئین ها می شوند . این مولکولهای جذب شده به گروههای قطبی ، اثر دفعی بر یکدیگر دارند . برا اثر این نیروهای دفعی بر سطح ، مولکول پروتئین باز شده و متورم می گردد . همین امر گروههای آبگریز در سطوح داخلی پروتئین را در معرض محیط خارجی قرار می دهد . ورود آب و اوره به محیط داخلی پروتئین سبب ایجاد بی ثباتی و بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین می شود .
از طرف دیگر اوره از طریقی غیر مستقیم و با تغییر در ساختار و دینامیک آب می تواند در بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین مؤثر باشد . حضور این ماده باعث اختلال در شبکه پیوند هیدروژنی بین مولکولهای آب شده و ایجاد فضایی خالی در بین مولکولهای آب می نماید . این کاهش نا مطلوب در آنتروپی با فشار مولکولهای آب به مولکولهای آبگریز جبران می شود ، تا کمترین فضای ممکن را ایجاد نمایند . این پدیده به اثر آبگریزی (Hydrophobic Effect) موسوم است . اوره در غلظتهای بالا (6 الی 8 مولار ) ، نیروهای مؤثر در متراکم کردن ساختمان پروتئین ها به خصوص اثر آبگریزی را کاهش می دهد . به این ترتیب به طور غیر مستقیم ، قسمتهای مرکزی آب گریز در معرض و در دسترس عوامل محیطی قرار می گیرد .
زمانی که به شرایط کائوتروپیکی قوی نیاز باشد ، ترکیبی از تیواوره 2 مولار و اوره 5 الی 8 مولار مورد استفاده قرار می گیرد . تیواوره در مقایسه با اوره دناتوره کننده قوی تری است . اما نمی توان آن را به تنهایی مورد استفاده قرار داد ، چرا که حلالیت بسیار کمی در آب دارد . این ماده در محلول غلیظ اوره حلالیت بیشتری دارد . به همین دلیل مخلوط های اوره – تیواوره قدرت محلول کنندگی بهتری را از خود نشان می دهند . به علاوه این ترکیب قادر به جلوگیری از فعالیت آنزیمهای پروتئولیتیک نیز هست که در حضور اوره به تنهایی هم ممکن است فعال باقی بمانند .
درجه خلوص اوره بسیار مهم است و باید از حرارت دادن آن ، به دلیل تشکیل ایزوسیانات که از تجزیه اوره حاصل می شود ، خودداری کرد . ایزو سیانات باعث کربامیلاسیون پروتئین ها و تشکیل نقاط غیر واقعی در الگوی نهایی الکتروفورز 2 بعدی می شود . محلول حاوی اوره پایدار نیست و از ذوب و انجماد مکرر محلول حاوی اوره باید خودداری کرد . از طرفی دیگر ، اگر چه استفاده از تیواوره در نمونه باعث افزایش در بروز نقاط پروتئینی می شود ، اما ایجاد رگه های (Streaking) عمودی و نقاط مبهم و نامشخص در ناحیه اسیدی ژل را نیز سبب می شود که هنوز راه حل مناسبی جهت حذف این زواید پیدا نشده است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پیشرفت تکنیکها و روشها برای تخلیص پروتئینها ، برای پیشرفت بیوتکنولوژی ضروری است . این هند بوک که از اطلاعات و مثال های فراوانی تشکیل شده است ، برای هموار شدن مسیر تخلیص پروتئین ها تهیه شده است . گوناگونی مراحل تخلیص پروتئین از یک ته نشینی ساده تک مرحله ای ، تا یک پروسه معتبر لارج اسکل (Large Scale) ، می تواند باشد . اما اغلب ، بیشتر از یک مرحله برای رسیدن به خلوص مورد نظر ، برای تخلیص پروتئین ها مورد نیاز است .
کلید موفقیت و مؤثر بودن یک تخلیص ، در انتخاب کردن و برگزیدن از بیشترین تکنیکهای مناسب ، بالا بردن کارآیی توسط جور کردن ملزومات ، و آمیختن آنها در یک راه منطقی ، که مستلزم حداقل تعداد مراحل و حداکثر محصول است . در بیشتر طرحهای خالص سازی ، مبحث یکی از انواع کروماتوگرافی به میان می آید . چنانچه در هر آزمایشگاه تخلیص پروتئین ، ابزار کروماتوگرافی بسیار ضروری است . تکنیک های مختلف کروماتوگرافی با انتخاب پذیری های متفاوت ، می تواند ترکیب قدرتمندی را برای تخلیص هر بیومولکول ایجاد نماید . توسعه تکنیک های recombinant DNA انقلابی در تهیه پروتئین ها در مقیاس بالا می باشد . پروتئین های recombinant اغلب با روش راحت تری تولید می شوند ، اما بعد از تولید ، نوبت مرحله تخلیص به روش کروماتوگرافیست و این روش هنوز در همه تولیدات ، کاربردی است . گروههای آلوده کننده و مشکلات مربوط به انحلال آنها، ، حفظ ساختمان بی عیب و فعالیت بیولوژیکی مواردی است که باید ملاحظه شود .
اگر چه در آن ممکن است پارامتر های فراوانی ظاهر شود ، که باید ملاحظه شود ، اما با تعدادی راهنمایی ساده و همچنین به کارگیری سه مرحله در استراتژی تخلیص ، فرایند می تواند به صورت ساده و راحتی طراحی و انجام شود . این امر ممکن نیست مگر با دانستن اصول بنیادی و تفصیل تکنیکهای کروماتوگرافی .
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 18 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت9:5 | |
محلول سازی نمونه ها برای الکتروفورز 2 بعدی
محلول سازی نمونه ها برای الکتروفورز 2 بعدی
در نظر گرفتن ماهیت نمونه ، در انتخاب راهکار مناسب برای محلول ساختن پروتئینهای موجود در نمونه بسیار مهم است . در صورتیکه نمونه مورد نظر از منابع سلولی یا بافتی استخراج شود ، اولین قدم لیز سلولها و خارج کردن محتوای پروتئینی آنهاست . روشهای متفاوت مکانیکی و شیمیایی در لیز و متلاشی ساختن سلولها به کار گرفته می شود. این روشها ممکن است ، روشهای ملایمی چون شکست دیواره سلول باکتریها توسط آنزیم لایزوزایم(Lysozyme) ، یا روشهای خشنی چون استفاده از پرس فرانسوی (French press) برای متلاشی ساختن سلولهای مخمری باشد .
به هر حال در روش مطلوب محلول سازی برای الکتروفورز دو بعدی باید تمام پیوندهای غیر کووالانت در کمپلکسهای پروتئینی ، شکسته شده و تجمع پروتئینی به پلی پپتیدهای منفرد و محلول تبدیل شوند . به علاوه روش محلول سازی باید اجازه خارج ساختن موادی نظیر نمکها ، لیپیدها ، پلی ساکاریدها و اسیدهای نوکلوئیک را که می توانند باعث اختلال در جدا سازی توسط الکتروفورز دو بعدی شوند ، به وجود آورد . در نهایت پروتئین ها ی نمونه باید در حین روند الکتروفورز دو بعدی ، محلول باقی بمانند . به همین دلایل محلول شدن نمونه یکی از عوامل بسیار حساس برای جداسازی پروتئینها توسط الکتروفورز 2 بعدی است .
روشهای متلاشی ساختن سلولها
روشهای متلاشی ساختن سلولها به منظور استخراج محتوای پروتئینی آنها ، دامنه وسیعی از روشهای فیزیکی و شیمیایی ملایم تا خشن را در بر می گیرد . ممکن است لیز سلولی به طور مستقیم در تماس با بافر محلول سازی صورت پذیرد یا در مواردی ممکن است از امواج مافوق صوت (Sonication) برای این منظور استفاده شود . حتی در برخی موارد ترکیبی از روشهای مختلف برای نیل به استخراج کامل پروتئین های نمونه استفاده می گردد .
متلاشی ساختن نمونه ها باید در سرما صورت پذیرد و نمونه مورد نظر در حین این روند باید روی یخ نگهداری شود . برای حفظ نمونه های پروتئینی از عملکرد پروتئاز های آزاد شده در حین متلاشی ساختن سلولها باید تمهیداتی در نظر گرفته شود . یکی از روشهای معمول متلاشی ساختن مستقیم سلولها در محلولهای لیز کننده ای است که سریعا پروتئاز ها و دیگر فعالیت های آنزیمی را متوقف کند . این محلولها عموما دارای مواد دناتوره کننده قدرتمندی هستند .
الف- روشهای متلاشی ساختن ملایم
این روشها معمولا زمانی به کار گرفته می شوند که نمونه مورد نظر حاوی سلولهایی است که به راحتی لیز می شوند ، سلولهایی نظیر سلولهای بافتی کشت داده شده ، سلولهای خونی و برخی از میکرو اورگانیسم ها . به علاوه از این روشها در مواردی هم که فقط تمرکز در بررسی یکی از اجزاء تحت سلولی است ، استفاده می شود . برای مثال می توان شرایطی را انتخاب کرد که فقط پروتئین های سیتو پلاسمیک آزاد شوند . یا میتوکندری های دست نخورده یا ارگانلهای دیگر توسط سانترفوژ تمایزی جدا شوند . برخی مواقع این روشها در ترکیب با یکدیگر استفاده می شوند . از روشهای ملایم متلاشی سازی سلولی می توان موارد زیر را نام برد .
1- لیز توسط دترجنت
دترجنت ها غشاء سلولی را حل می کنند و باعث لیز سلول و آزاد کردن محتوای آن می شوند . در بیشتر موارد سلولها مستقیما در بافر محلول سازی یا بافر خیساندن Rehydration Buffer لیز می شوند . چرا که این بافرها همیشه دارای دترجنت هستند . رایج ترین روش برای محلول سازی پروتئین ها در الکتروفورز 2 بعدی همان روشی است که در ابتدا توسط Farrell در سال 1975 شرح داده شده است . در این روش از اوره 9.5 M ، 4% دترجنت غیر یونی NP40، 1% ماده احیاء کننده دی تیو تریتول (DDT) و 2%آمفولایت (Ampholyte) در محدوده مناسب استفاده شده است که به آن اصطلاحا بافر لیز کننده (Lysis Buffer) می گویند . در حالی که این روش در بسیاری از انواع نمونه ها به خوبی نتیجه می دهد ، نمی توان از آن به طور گسترده ای استفاده کرد . چرا که محلول سازی پروتئین های غشایی چالش این روش است . دترجنت های دو یونی (Witterionic) ، مانند CHAPS ، در محلول سازی پروتئین های غشایی بسیار مؤثرند . به خصوص که با غلظت 4% و در ترکیبی با مخلوطی از تیواوره 2M و اوره 8M استفاده شود . دترجنتهای سولفوبتائین خطی نظیر SB3-10 یا SB3-12 نیز معرفهای حل کننده مؤثری هستند ، اما با غلظتهای بالای اوره سازگار نیست . این مسئله با استفاده از غلظت 2% این معرفها در ترکیب با اوره 1M و تیواوره 2M و CHAPS2% برطرف شده است . دترجنت سدیم دودسیل سولفات SDS نیز قادر است واکنشهای پروتئینی غیر کووالانت را بشکند و معرف بسیار مؤثری در محلول سازی پروتئینهای غشایی است . اما خاصیت آنیونیک این ماده استفاده از آن را در IEF دچار مشکل می نماید . در هر صورت می توان از SDS به عنوان یک روش پیش محلول سازی ، در مورد نمونه هایی که قرار است الکتروفورز 2 بعدی گردند ، استفاده کرد . در این روش ابتدا نمونه در محلول 1%SDS حل می شود و بعد با محلول های حل کننده عادی مانند بافر لیز کننده رقیق می شود . در اینجا هدف خارج کردن SDS از پروتئین ها و جایگزینی آن با دترجنت های دو یونی یا غیر یونی است ، تا پروتئین ها در وضعیت محلول باقی بمانند . نسبت پروتئین به دترجنت دو یونی یا غیر یونی 1:3 و نسبت SDS به این دترجنتها 1:8 است و این نسبت ها باید به دقت کنترل گردند ، تا محلول سازی کاملا انجام شود و در عین حال اثرات مخرب SDS بر روی IEF به حداقل برسد .
2- لیز اسموزی
این روش در مواردی که نیاز به جدا سازی اجزاء تحت سلولی است به کار گرفته می شود . سلولهای خونی و سلولهای کشت بافتی به این روش پاسخ مطلوبی می دهند . در این روش سلولها در محلولی هیپواسموتیک Hyposmotic قرار داده می شوند .
3- لیز توسط یخ زدن و ذوب کردن (Freez-thaw lysis)
در این روش سلولها در یک یا چند نوبت متوالی به سرعت در نیتروژن مایع ، یخ زده می شوند و سپس ذوب می شوند .
4- لیز آنزیمی
دیواره سلولی در بافتهای گیاهی ، سلولهای باکتریایی و قارچی را می توان با استفاده از آنزیم اختصاصی برداشت . و سپس سلول را لیز کرد . لایزوزایم برای سلولهای باکتریایی ، سلولاز و پکتیناز برای سلولهای گیاهی ، و لایتیکاز برای مخمرها در یک محلول ایزواسموتیک حل شده و مورد استفاده قرار می گیرد .
ب- روشهای متلاشی ساختن خشن
سلولهای موجود در بافت ها و سلولهایی که دیواره سلولی مستحکمی دارند ، به سهولت متلاشی نمی شوند و باید از این روشها برای لیز آنها استفده کرد . باید در هنگام استفاده از این روشها ، از ایجاد حرارت و کف ممانعت کرد .
1-استفاده از امواج مافوق صوت
امواج صوتی تولید شده توسط یک سونیکاتور باعث لیز سلولها از طریق ایجاد برشهایی در دیواره سلولی می شوند . زمانیکه امواج مافوق صوت حداکثر تلاطم را در سیستم سلولی به وجود می آورند ، این برشها ایجاد می شوند .برای ممانعت از افزایش درجه حرارت سوسپانسیون سلولی و ایجاد کف ، ظرف سوسپانسیون سلولی در حمام یخ قرار داده می شود . و سونیکاسیون در مقاطع زمانی کوتاه مدت با فواصل زمانی معین صورت می پذیرد .
2-پرس فرانسوی
ایجاد پارگی در دیواره سلولی در این روش به دلیل گذر دادن سوسپانسیون سلولی از منفذی بسیار کوچک تحت فشار بسیار زیاد است . این روش بسیار ساده ، کارآمد و سریع است و معمولا برای میکرو اورگانیسم های دارای دیواره سلولی به کار برده می شود .
3-آسیاب کردن (Grinding)
برخی از مواقع از سیستم هاون دستی مخصوص برای آسیاب سوسپانسیون سلولی یا بافت ها استفاده می شود . برای این منظور قطعه بافتی مورد نظر سوسپانسیون سلولی در نیتروژن مایع یخ زده می شود و با این هاون سلولی پودر می شوند . می توان برای بهبود این روش به مخلوط در حال هاون شدن ، شن یا آلومینا (Al2O3) اضافه کرد .
4-هموژنیزه کردن
این روش ممکن است بصورت مکانیکی با کمک همزنهای برقی صورت گیرد که عموما برای نمونه های بافتی به کار گرفته می شود . استفاده از دانه های شیشه ای (Glass Bead) روش دیگر برای هموژنیزه کردن نمونه های سوسپانسیون سلولی است که با همزدن شدید سوسپانسیون حاوی این دانه ها ی شیشه ای در فواصل زمانی تکراری صورت می گیرد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
آنالیز ، تخلیص و شناخت پروتئینها ، که هر کدام از آنها وظیفه ای خاص دارند ، باعث می شود ، بشر در آینده نزدیک کارهایی بتواند انجام دهد که نظیر نداشته باشد و تا به حال قادر به انجام آن نشده است . یکی از این کارها ، در زمینه پزشکی و ساخت دارو ها و معالجه بیماران صعب العلاج است . همانگونه که می دانیم بسیاری از بیماری ها به دلیل عدم سنتز یک ، یا چند نوع پروتئین است ، که خود این عدم سنتز می تواند علت های خاصی داشته باشد . هورمونها و آنزیم ها و مولکولهای مهمی ، که عدم وجود آنها ، مشکلات فراوانی را سبب می شود . پروتئومیکس در تشخیص این پروتئین ها کمک شایانی انجام می دهد . مثلا تشخیص پروتئین هایی که فقط در سلول های سرطانی تشکیل می شود ، و در سلولهای سالم دیده نمی شود . یا در تشخیص پروتین هایی که وجود و یا عدم وجود آنها ، در مغز یک انسان ، مشکلات خاصی مانند ms و عقب ماندگی های ذهنی و نظایر آنها ، ایجاد میکند . این رشته می تواند به پزشکان در ایجاد راهکارهایی برای درمان این نوع از بیماریها کمک کند . پزشکانی که روحیه تحقیق داشته باشند ، می توانند ایده های خوبی را دنبال کنند ، که فقط راه رسیدن به تحقق آنها ، پروتئومیکس و ژنومیکس است .
به عنوان مثال ، می توان سلول های مغز یک انسان عقب افتاده ذهنی را ، با سلول های مغز یک انسان سالم ، مقایسه کرد ( این بیماریها که اکثرا تا به حال ، لا علاج و ژنتیکی هستند ، بسیار جای کار دارند ) . این کار فقط با روش الکتروفورز 2 بعدی امکان پذیر است . اگر بیماری فرد ، به خاطر عدم سنتز یک یا چند نوع پروتئین باشد ، اگر بتوانیم این پروتئین ها را تهیه و تخلیص کنیم و یا به صورت مصنوعی ، یا روش های ژنومیکس سنتز کنیم و آنگاه ، به سلول برسانیم ، در حقیقت کلید حل این بیماری را یافته ایم و گام بزرگی را برداشته ایم .
نویسنده : ابوذر عسکری
9/10/1389
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در دو شنبه 9 دی 1389برچسب:پروتئومیکس,
در ساعت2:24 | |
خصوصیات و کاربردهای مواد شیمیایی پر مصرف در پروتومیکس 2
Acrylamide , 2-propenamide
اکریل آمید ، 2-پروپن آمید
Monomer unit of polyacrylamide in gels , hydrogels, hard polymers ; environmental carcinogen ; fluorescence quencher.
سرطان زا ، واحد سازنده (مونومر) پلیمر پلی آکریل آمید در ژل ها
خصوصیات و کاربردهای مواد شیمیایی پر مصرف در پروتومیکس
برای اینکه دید بهتری از واکنشهای بیوشیمی و شیمی برای محققین حاصل شود ، و محققین بتوانند ابتکار عمل بیشتری در طراحی داشته باشند ، لازم است با ساختمان مواد ، همچنین خصوصیات ، ویژگی ها و کاربردهای آنها بیشترآشنا شوند . به این خاطر بر آن شدیم این بخش را با این محتوا راه اندازی نماییم . از شما دوستان نیز برای این کار دعوت به عمل می آید ، تا در این امر مهم ما را یاری نمایند . برای این کار شکل ساختمان ماده شیمیایی ، خصوصیات و کاربرد های آن در پروتومیکس را ، برای ما ارسال نمایید ، تا ما آن را با نام خودتان در وبلاگ ، به نمایش گذاریم .
**********************************************
Acetaldehyde , Ethanal
استالدئید ،اتانال
Manufacturing intermediate; modification of amino groups; toxic chemical
>>> کاربران عضو می توانند در این وبلاگ مطلب بگذارند <<<
( البته پس از بررسی مطلب ، توسط مدیر ، و به اسم کاربر عضو این کار انجام خواهد گرفت )
>>>ما علاقمند به تبادل لینک ، با تمام مدیرانی که وبلاگ یا وب سایت علمی دارند ، هستیم <<<
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در 6 دی 1389برچسب:,
در ساعت15:35 | |
انواع نمونه برای الکتروفورز 2 بعدی
به خاطر تفاوت در ماهیت و ساختار در انواع نمونه ها , روشهای آماده سازی برای نمونه هایی که از منابع مختلف به دست می آیند , با هم اختلاف دارند . در ذیل این مقاله ، این نمونه ها را به انواع مختلف تقسیم بندی کرده ، در مورد آن توضیح می دهیم .
1- نمونه های محلول :
نمونه های محلول و مایع نظیر ، سرم ، پلاسما ، مایع نخاعی و عصاره مایع سلولها و بافتها را می توان در اکثر موارد با کمترین تغییر و دستکاری ، توسط الکتروفورز 2 بعدی بررسی و مطالعه کرد .
نمونه هایی مانند سرم و پلاسما را که دارای غلظت بالایی از پروتئین ها هستند ؛ را می توان با رقیق سازی توسط بافرهای محلول کننده مناسب ، برای انجام تست الکتروفورز 2 بعدی آماده کرد . در این روش بالا بودن غلظت بعضی از پروتئین ها ، مثل آلبومین و یا ایمونوگلوبین ها ، می تواند باعث پوشاندن بعضی از پروتئین ها که غلظت کمی دارند گردد . با خارج کردن این پروتئین ها می توان این مشکل را از بین برد . اما با خارج کردن این پروتئین ها ممکن است ، بعضی دیگر از پروتئین ها نیز خارج گردد .
2 موضوع دیگر نیز ممکن است ، در الکتروفورز 2 بعدی ایجاد مشکل نماید .
الف- وجود نمک های اضافی در محلول
ب- غلظت کم پروتئین ها در محلول
مشکل اول را می توان با دیالیز نمونه و یا کروماتوگرافی با sephadex G25 حل کرد و نمک های اضافی را از نمونه خارج کرد . مشکل دوم را می توان با رسوب دادن پروتئین ها ، به وسیله موادی که باعث رسوب کردن آنها می شود ، حل کرد . موادی مثل ؛ آمونیوم سولفات ، TCA ، یا استن . همچنین می توان با خارج کردن آب از نمونه ، آن را غلیظ کرد . مثل دیالیز در مقابل پلی اتیلن گلایکول و یا لیوفیلیز کردن نمونه .
رسوب دادن نمونه با استن – TCA برای غیر فعال کردن پروتئاز ها و خارج کردن مولکولهای تداخل کننده و برای تغلیظ پروتئین های بسیار قلیایی ، مثل پروتئین های ریبوزومی ، در محلول لیز شده سلولی بسیار مفید می باشد .
2- نمونه های بافتی :
برای تهیه نمونه از بافت جامد , معمولا بافت را توسط بافر محلول کننده ، حل می کنند . بهترین روش استفاده از نیتروژن مایع است . نمونه های کوچک را که در یک فویل آلومینیومی قرار دارد و در نیتروژن مایع , یخ زده است ، را می توان به راحتی در یک هاون خرد کرد . نمونه های بزرگ را می توان با هموژنه کردن در بافر محلول کننده ، توسط هموژنایزر آماده کرد . برای اینکه بتوان از آسیب پذیری پروتئین ها در اثر حرارت جلوگیری کرد ، باید حرارت تولید شده توسط هموژنایزر را از محیط نمونه خارج کرد .
مشکل خاص در آنالیز نمونه های بافتی ، عدم وجود یک دستی در ماهیت بافت است . همانطور که می دانیم بافت ها از انواع مختلف سلول تشکیل شده است . حتی یک نوع سلول نیز ممکن است از اختلاط سلولهای سالم و ناسالم تشکیل شده باشد . روشهای مختلفی برای جداسازی و تفکیک این سلولها وجود دارد . با استفاده از گزینش مثبت یا منفی و معمولا بر اساس یک روش ایمونوافینیتی ، امکان غنی سازی یک سلول خاص از جمعیت کل آنها و کشت آن قبل از انجام تست وجود دارد . همچنین از روشهای میکروسکوپی مانند (Laser Capture microdessection LCM ) نیز می توان برای جداسازی آنها استفاده کرد .
البته روش LCM برای آنالیز اسیدهای نوکلئیک بهتر است ، چون در کنار آن از PCR برای تولید و تقویت اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود ، اما در آنالیز پروتئین ها ، دستگاهی که کار PCR را انجام دهد و پروتئین ها را افزایش دهد ، وجود ندارد .
3- نمونه های سلولی :
نمونه هایی که در محیط آزمایشگاه به صورت سوسپانسیون رشد داده می شود و یا نمونه هایی مانند خون ، لنفوسیتها و غیره را سانتریفوژ کرده ، توسط PBS (بافر فسفات سالین) شستشو کرده و در بافر محلول کننده حل می نمایند .
سلول هایی که در محیط جامد کشت داده می شوند را ابتدا باید از محیط کشت جدا کرد . قبل از جدا کردن سلول ها بهتر است آنها را با یک بافر ایزوتونیک شستشو کرد . برای این منظور محلول ایزوتونیک سوکروز پیشنهاد می گردد . زیرا یونهای موجود در بافر PBS ممکن است در نتیجه الکتروفورز تأثیر منفی گذاشته و تداخل ایجاد نماید . در صورت استفاده از PBS می توان نمونه را قبل از انجام تست ، دیالیز کرد . پس از شستشو سلول ها را توسط لوپ یا اسکراپر برداشته و در بافر محلول کننده حل نمایید .
در صورتی که نمونه حاوی مقادیر زیادی اسید نوکلئیک باشد ، ویزکوزیته آن بالاست . در این مورد می توان از RNase و DNase استفاده کرد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بنا به درخواست عده ای از دوستان ، مبنی بر اینکه خواستار انجام تست الکتروفورز 2 بعدی توسط ما شده بودند ، تصمیم بر این گرفته شد ، با شرایطی این کار انجام شود .
1- آماده سازی مقدماتی نمونه با خود ایشان باشد . (در صورت نیاز جهت آماده سازی نمونه مشاوره داده خواهد شد )
2- تهیه ژل IPG توسط ایشان .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
راهنمایی های کلی در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز 2 بعدی (2DE)
روش آماده سازی نمونه علاوه بر کارآمد بودن ، باید تکرار پذیری نیز داشته باشد . این نکته بسیار مهم است . در نمونه سازی ممکن است از مواد زیادی مانند دترجنت ها ، عوامل کائوتروپیک و عوامل احیا کننده استفاده شود . در هر حال بهینه کردن روش آماده سازی نمونه به صورت تجربی صورت می پذیرد . اما موارد زیر را می توان در نظر داشت .
1- به حداقل رساندن مراحل آماده سازی نمونه :
افزایش مراحل آماده سازی نمونه اگر چه در مواردی موجب بهبود کیفیت نمونه می گردد ، اما اکثرا موجب هدر رفتن وقت و مواد و نیز از دست رفتن پروتئین ها می گردد .
2- ممانعت از توده ای شدن پروتئین ها :
پروتئین ها به هیچ وجه در نمونه و یا در مراحل بعد از الکتروفورز ، نباید رسوب و یا حلالیت آنها از بین برود .
3- خارج کردن اسیدهای نوکلوئیک و دیگر مولکولهای تداخل کننده :
مانند نمک ها و چربی ها و قند ها
4- حذف موادی که می توانند تولید ذره نمایند :
این مواد ( لیپیدها و مواد جامد ) باید از محیط نمونه خارج گردند .
5- محلول سازی تمام انواع پروتئین ها ( چه آبگریز و چه آبدوست ) :
باید تمام انواع پروتئین ها در محلول به صورت آزاد باشند ، یعنی تمام پیوند های غیر کووالان در کمپلکس ها و توده های پروتئینی از بین برود .
6- به حداقل رساندن تغییرات پروتئینی در نمونه :
مانند اثر آنزیم ها و اثر گرما
7- حذف پروتئین هایی که فراوانی زیادی در نمونه دارند :
این پروتئین ها ، دیگر پروتئین های نمونه را تحت پوشش می دهند.
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
قدم اول در آماده سازی نمونه استخراج پروتئین ها از منبع مورد نظر است . ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیما توسط بافر محلول سازی Solubilization Buffer صورت پذیرد . ممکن است این عمل توسط روش های متلاشی ساختن سلولها Cell disruption و بافتها انجام شود و سپس پروتئین های استخراج شده در بافر محلول سازی کاملا حل شوند . برای استخراج کامل پروتئین های داخل سلولی ، سلول باید کاملا متلاشی شود . انتخاب روش متلاشی سازی بستگی به این دارد که نمونه از چه منبع بیولوژیکی ، سلول ، بافت جامد و یا از منابع دیگری ، به دست آمده باشد . بعد از استخراج ، این نمونه ها باید برای انجام الکتروفورز دو بعدی آماده شوند . منظور از آماده سازی نمونه ، محلول ساختن حداکثر پروتئین های موجود و حفظ حلالیت آنها در حین روند الکتروفورز دو بعدی است .
هیچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هایی که توسط الکتروفورز دو بعدی مورد بررسی قرار می گیرند ، معرف کرد . در واقع ماهیت متفاوت نمونه ها امکان به کار گیری روشی یکسان را در آماده ساختن آنها برای الکتروفورز دو بعدی منتفی می سازد . از طرفی دیگر ، روش بکار گرفته شده در هر تجربه ای به هدف طراحی شده نیز بستگی دارد . برای مثال ، ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی دستیابی به پروتئین هایی با ویژگی های خاص باشد ، یا ممکن است دستیابی به نقشه کامل پروتئینهای نمونه ، از اهمیت بیشتری برخوردار باشد . در هر یک از این موارد استراتژی های انتخابی کاملا با هم تفاوت دارند . در بهینه سازی استراتژی آماده سازی نمونه باید از نتایج مورد نظر ، انتظاری مشخص داشت . باید برای ما مشخص باشد که نشان دادن نمونه به طور کامل مهمتر است ، یا به دست آوردن یک الگوی تکرار پذیر .
اضافه کردن مراحل آماده سازی نمونه می تواند کیفیت نتیجه نهایی را بهتر کند ، اما این امر به قیمت از دست دادن گروهی از پروتئین ها تمام می شود . به هر حال ، این تناقض و نسبت معکوس بین کیفیت نمونه بهبود یافته و نمونه سازی کامل پروتئین ها باید کاملا در نظر گرفته شود .
در هر صورت ، خطوط راهنمای کلی ،برای آماده سازی نمونه وجود دارد که با پیگیری آنها می توان قدمهای نخست را در این راه به درستی برداشت و سپس با تجربه بهترین نمونه را بدست آورد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
برای اینکه بدانیم یک نمونه استخراج شده ، از چه تعداد پروتئین تشکیل شده است و بتوانیم پروتئین ها را مورد بررسی قرار دهیم ، از این روش استفاده می کنیم . در حقیقت با این روش نقشه پروتئینی یک نمونه را به دست می آوریم . همان گونه که می دانیم یک موجود زنده در شرایط متفاوت ، رفتار های متفاوتی را از خود نشان می دهد ، تا خود را با آن شرایط تطبیق دهد . مثلا تغییر در محیط کشت یک باکتری ، از نظر رژیم غذایی ، باعث ترشح آنزیم های متفاوتی می شود . اگر در محیط کشت نشاسته وجود داشته باشد ، باکتری آنزیمی را ترشح می کند ، که بتواند آن نشاسته را هضم کند . اگر در محیط کشت باکتری از چربی یا پروتئین استفاده شود ، باکتری آنزیمی ترشح می کند که بتواند آنها را هضم کند . پس تغییر در محیط کشت از نظر رژیم غذایی ، باعث تغییر کمی و کیفی در پروتئین های باکتری و به دنبال آن تغییر در نقشه پروتئوم آن باکتری می شود . همینطور تغییرات فیزیکی و شیمیایی در پیرامون باکتری ، سبب تغییرات در نقشه پروتئوم باکتری می شود . در سایر موجودات نیز این تغییرات ثبت شده اند . مثلا آنزیم پراکسیداز در ترب سیاه سالم و ترب سیاه ضخمی شده از نظر مقدار تفاوت دارد . این تغییرات را می توان با روش الکتروفورز 2 بعدی مشخص نمود.
در این روش پروتئین ها در محور X توسط میدان الکتریکی و اختلاف در PI آنها جدا می شوند . سپس در محور Y بر اساس تفاوت در جرم مولکولی جداسازی می شوند. به این ترتیب یک نقشه پروتئینی برای یک نمونه تشکیل می شود .
نویسنده : ابوذر عسکری
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اگر از سمپلر شما ، قطره قطره می چکد ، باید سر سمپلر را تا جایی که امکان دارد محکم نمایید . البته در بعضی از مواقع که از ، مواد بسیار فرار استفاده می شود ممکن است این حالت پیش آید . اگر مشکل حل نشد ، باید آن را باز کرده و تمیز کرده و گریس مخصوص آن را استفاده کنید .
کالیبره کردن سمپلرها :
باید سمپلر ها هر چند وقت یک بار کالیبره شود . معمولا سمپلر ها در انتهای خود یک پیچ تنظیم کننده دارند ، که در زیر یک لاستیک قرار دارد .
برای کالیبره کردن آن باید از یک ترازوی دقیق استفاده شود . سمپلر را روی آخرین مقدار خود ، مثلا برای سمپلر 100 لاندا روی ، 100 لاندا یا برای سمپلر 1000 لاندا روی ، 1000 لاندا تنظیم کنید و به وسیله آن یک حجم از آب مقطر را وزن کنید . چون دانسیته آب مقطر یک است و یک گرم آب مقطر یک ml می باشد ، پس وزنی که ترازو نشان می دهد ، باید 1000 میلی گرم باشد . 3 بار این کار را به یک روش انجام دهید . دقت شود که با یک روش حجم ها را توسط سمپلر بردارید و، این کار را بسیار آرام انجام دهید . از وزنهای بدست آمده میانگین گرفته شود . اگر میانگین آنها کمتر از 1000 لاندا بود یا بیشتر بود ، می توانید با پیچ تنظیم کننده ، آن را تغییر دهید و کالیبره نمایید . این کار را تا هنگامی که میانگین وزنها به 1000 لاندا برسد ، باید تکرار کرد .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
نمونه های خود را یکی با همان غلظت و دیگری با 1/10 غلظت , دیگری را مثلا با 1/50 رقیق کنید
حالا باید طبق روش لوری جذب ها را بخوانید .نمودار خود را بر حسب mg/ml پروتئین و جذب بکشید .جذب های استاندارد را می خوانید و در روی محور ایگرگ می نویسید . غلظت های استاندارد را نیز روی محور ایکس مشخص کنید . بهترین خطی که از این 5 نقطه عبور می کند , یا به صورت دستی یا با نرم افزار اکسل رسم کنید .
با توجه به جذب نمونه های خود , به طوری که یک خط افقی از Abs (جذب) مورد نظر رسم می کنید , تا به منحنی استاندارد برخورد کند و از همان جا یک خط عمودی بکشید تا به محور ایکس برسد . جایی را که به محور ایکس برخورد کرده مشخص کنید .این نقطه غلظت پروتئین مورد نظر شما می باشد. سپس عدد به دست آمده را در ضریب رقت خود ضرب کنید.
در این روش از نمونه هایی که در بالا رقیق کرده اید آن نمونه ای را انتخاب کنید که عدد آن بین اعداد استاندارد باشد .
مثلا یک نمونه دارید که غلظت آن نا مشخص است . ابتدا از این نمونه چند رقت بسازید .
1/1 ، 1/10 ، 1/20 ، 1/50
استاندارد های خود را بسازید
BSA 0.1mg/ml 0.2 mg/ml 0.3 mg/ ml 0.4mg/ml 0.5mg/ml
طبق روش لوری عمل نمایید .منحنی استاندارد را در نمودار رسم کرده و بهترین خط را طبق آن رسم کنید .جذب نمونه ها را بخوانید . نمونه ای که جذب آن در محدوده جذب استانداردها است انتخاب کنید ( بقیه آنها دقت کافی را نخواهد داشت ) . یعنی نقاطی که به خط قهوه ای برسد فاقد اعتبار است . از نقطه ای که جذب آن مشخص است یک خط افقی رسم کنید تا به خط سبز برسید .سپس از آنجا یک خط رسم کنید تا محور ایکس را قطع کند . این نقطه غلظت نمونه شما است .که اگر رقیق کرده باشید , باید این عدد را در ضریب رقت ضرب کنید .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
دوستان یک سری از سایت های مهم در رابطه با مقالات ، ژورنالها و مجلات خارجی که مبحث آنها پروتئومیکس است ، را در قسمت لینکدونی قرار داده ام ، که اکثرا رایگان است .
آشنایی با برخی نشریات مرتبط با پروتئومیکس
در این قسمت برخی نشریات مرتبط با پروتئومیکس معرفی میشوند. بدیهی است که این نشریات تنها نمونه هایی از نشریاتی هستند که به طور کامل یا جزئی بخشی از مقالات منتشره خود را به موضوع پروتئومیکس اختصاص داده اند ، و فهرست این نشریات درحال گسترش است.
این نشریه یکی از قدیمیترین ومعتبرترین نشریات فعال درزمینه پروتئومیکس است که از سال 2001 فعالیت به چاپ مقالاتی در زمینه Proteomics خود را آغاز کرده است و مقبولیت و اعتبار زیادی دارد. در حال حاضر به تکنیکها و کاربردهای پروتئومیکس میپردازد.
این نشریه درحال حاضر از معتبرترین نشریات پروتئومیکس است. در این نشریه مقالاتی در زمینه تحلیل سیستمهاي زیستی و آنالیز فراگیر پروتئینها وعملکرد آنها انتشار مییابد.
در این نشریه تنها مقالات مروري (Review) به چاپ میرسند . در این نشریه تلاش میشود که راجع به هر موضوع، دیدگاه جامعی از اهمیت یک تکنولوژي خاص در تحقیقات یا کاربردهاي پزشکی ارائه گردد.
هدف این نشریه نیز انتشار مقالات مروري در زمینه پروتئومیکس است. دراین نشریه تمامی موضوعات مربوط به پروتئومیکس شامل روشها، نرمافزارها، پایگاه هاي اطلاعاتی، پیشرفت هاي تکنیکی و کاربردهاي جدید پروتئومیکس مورد بررسی قرار میگیرند. علاوه بر مقالات مروري، مقالاتی که به تبیین اهمیت تحقیقات و یافته هاي جدید درزمینۀ پروتئومیکس میپردازند نیز مورد توجه هستند.
درحقیقت یک نشریه تخصصی پروتئومیکس محسوب نمیشود. و بیشتر به انتشار BBA این بخش از نشریه مطالبی در زمینه ساختمان پروتئینها، برهمکنش لیگاند-پروتئین، مکانیسمها، مدلها و سینتیک آنزیمی، ویژگی هاي فیزیکی پروتئینها، اسپکتروسکوپی و نیز مقالات کریستالوگرافی میپردازد.
Beijing این نشریه توسط آکادمی علوم چین حمایت میشود ومدیریت آن برعهده انستیتو پروتئومیکس است. در این نشریه نتایج تحقیقات ژنومیکس، پروتئومیکس و بیوانفورماتیک انتشار مییابد. مقالاتی که به منابع اینترنتی و تکنیکهاي ژنومیکس و پروتئومیکس مربوط میشوند نیز میتوانند مدنظر قرار گیرند.
این نشریه به صورت online منتشر میشود و دسترسی به متن کامل مقالات آن محدودیتی ندارد. مقالات این نشریه درمورد پروتئومیکس وعلی الخصوص آنالیزهاي پروتئومیکس ساختاري وعملکردي در زمینه زیست شناسی سلولی و تکوین هستند. در این نشریه مقالات تحقیقاتی، تکنیکها و مقالات مروري به چاپ میرسند.
دراین نشریه مقالات ژنومیکس، ترانسکریپتومیک، پروتئومیکس، متابولومیک، گلیکومیک و مطالعات زیست شناسی سیستمها انتشار مییابند. پیشرفتهایی که در دوران پسژنومی در زیستشناسی و پزشکی حاصل گردیده اند مانند فارماکوژنومیکس (اندازهگیري کمی وابستگی پاسخ دارویی میزبان ها به تغییرات ژنتیکی ) و فیزیومیک ( physiomics ، تغییرات فیزیولوژیکی و عملکردهاي آن دریک موجود زنده کامل) دراین نشریه مورد توجه هستند.
این نشریه مجازي (virtual) در حقیقت یک نشریه مستقل نیست، بلکه ویراستارهاي آن مقالات جالب توجه را ازمیان 15 نشریه انتشارات Elsevier انتخاب نموده و خلاصه مقالات آنها را بدون هزینه در نشریه خود به صورت online ارائه میدهند. هر خلاصه مقاله با یک لینک به صفحه اینترنتی نشریه مربوطه ارتباط پیدا میکند.
این نشریه توسط انتشاراتSpringer به چاپ میرسیده است ولی انتشار آن خیلی زود متوقف شده است (به نظر میرسد تنها درسال 2000 مقالاتی منتشر نموده است). متن کامل مقالات این نشریه از طریق صفحه اینترنتی انتشارات قابل دسترسی میباشد.
سایر نشریات
نشریات زیاد دیگري با پروتئومیکس در ارتباط هستند که نامبردن از تمامی آنها در اینجا مقدور نیست. از این میان میتوان به نشریاتی که به انتشار تکنیکهاي جدید میپردازند مانند، Electrophoresis کلیه نشریات مرتبط با طیف سنجی جرمی
اثر ویسکوزیته نمونه بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
به ترتیب از A به C به وسیله افزودن دکستران , ویسکوزیته زیاد شده است .
ویزکوزیته زیاد باعث کم شدن رزولیشن می شود . همچنین ویزکوزیته نمونه نباید در حدی باشد ، که حرکت آن در هنگام عبور از میان ذرات ژل ، با مشکل مواجه شود . یعنی در اثر نیروی مکشی که در اثر خروج بافر (فاز متحرک ) ، یا فشار پمپ ، ایجاد می شود و عدم عبور راحت نمونه از میان ذرات ژل ، ژل فشرده نشود.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اثر حجم نمونه تزریقی بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
به ترتیب از آبی به قرمز حجم نمونه تزریقی به ستون ژل فیلتراسیون اضافه می شود .
حجم تزریقی نمونه به ستون کروماتوگرافی به روش ژل فیلتراسیون 2 الی 5 درصد حجم ژل می باشد . 2 درصد ایده آل و 5 درصد قابل قبول است . بدیهی است که در صورت افزایش این درصد کیفیت و رزولیشن گراف پایین می آید . همان طور که مشخص است در گراف قرمز ، پیک ها شارپ نیست ، یعنی عرض آنها زیاد است و مقدار جذب کمتری را در قله می بینیم . این امر باعث می شود که رزولیشن کمتری داشته باشیم.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
سرعت ، در جداسازی پروتئینهای یک نمونه تأثیر دارد ، در حقیقت کاهش سرعت فاز متحرک رزولیشن (Resolution) کروماتوگرافی را زیاد می کند ، همچنین باعث شارپ شدن پیک ها می شود . همانگونه که در گراف نارنجی مشخص است ، رزولیشن و ارتفاع پیک ها بیشتر است .
در این نمونه 7 نوع پروتئین وجود دارد ، گراف های بالا بر حسب (جذب پر حجم) (Abs/V) ولی گراف پایین بر حسب (Abs/min) است .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
یکی از مراحل ، برای تخلیص پروتئینها و همچنین شناسایی آنها ، که حتما باید مورد توجه قرار گیرد ، این است که باید نمونه را تا حد امکان عاری از یونهای مزاحم کرد . مراحلی نظیر الکتروفورز و یا نمونه آماده شده برای لود کردن در ستونهای کروماتوگرافی . این روش را که برای حذف یونهای مزاحم از نمونه انجام می گیرد ، دیالیز می نامند . همچنین می توان با کمک دیالیز محیط نمونه را حاوی یونهای دلخواه کرد . دیالیز در آزمایشگاه پروتئومیکس به وسیله کیسه دیالیز انجام می گیرد . این کیسه غشائی است نیمه تراوا ، که یونها به راحتی از میان جداره آن عبور می کنند ، ولی مولکولهای بزرگی مثل پروتئین ها قابلیت عبور از این جداره را نداشته ، درون کیسه باقی می مانند . جریان حرکت یون ها در دیالیز طبق قانون انتشار صورت می گیرد . همیشه یونها از جایی که غلظت آنها فراوان است ، به سمت جایی که غلظت آنها کم است در حرکتند . این حرکت مستقل از حرکت سایر یونها می باشد و هر نوع یون مستقل از یونهای دیگر ، همیشه از جایی که تعداد آنها بیشتر است ، به جایی که تعدادشان کمتر است حرکت می کنند . ممکن است این فراوانی در داخل باشد . در این صورت جریان حرکت از داخل به سمت بیرون است . همچنین ممکن است این فراوانی در خارج از کیسه باشد . پس نتیجه آن حرکت یونها از خارج به سمت داخل خواهد بود . در هنگام دیالیز ممکن است ، انواعی از یونها به داخل آمده و همزمان انواع دیگری از آنها ، به خارج بروند . این حرکت تا جایی ادامه پیدا می کند ، که غلظت هر نوع از یونها در داخل و خارج کیسه دیالیز برابر شود (به تعادل غلظتی برسند) .دیالیز با تعویض بافر ادامه پیدا می کند . دوباره یونها با حرکت خود و عبور از جداره کیسه ، باعث تعادلی دیگر می شوند .
2 عامل مقدار بافر و تعداد تعویض بافر در دیالیز نقش دارند . مقدار بافر به حجم نمونه بستگی دارد . اما تعداد تعویض بافر هر چه بیشتر باشد ، بهتر است .معمولا این تعداد کمتر از 3 بار نیست .
بعد از آماده سازی کیسه دیالیز و بستن انتهای آن با گیره مخصوص و یا با نخی کلفت (که باعث پارگی کیسه نشود) ، نمونه را در کیسه ریخته و ورودی آن را هم در صورت لزوم می بندند(در بعضی از موارد می توان ورودی را نبست ). کیسه را در بافر مورد نظر به صورت معلق و آویزان در آورده ، در صورت امکان یک مگنت در ظرف بافر انداخته و ظرف را روی همزن مغناطیسی قرار می دهند تا سرعت تبادل یونها بیشتر شود .
روش صحیح بستن انتها و ابتدای کیسه دیالیز :
بهترین روش همان گیره مخصوص کیسه دیالیز است . دو سطح کیسه (کیسه دیالیز در دو طرف خود 2 اثر تا خوردگی دارد) را دقیقا روی هم قرار می دهیم ، طوری که چروک نباشد . کیسه را از حدود یک الی دو سانتیمتری آخر آن ، یک تا زده و طوری که هنوز کیسه چروک نشده باشد ، گیره را در همین قسمت گذاشته و آن را می بندیم . در صورت نبود گیره می توان از نخی کلفت استفاده کرد .
ابتدای کیسه را هم می توان به 2 روش بالا و به همین ترتیب بست . اما در خیلی از موارد می توان این کار را نکرد . به شرط آنکه سر کیسه دیالیز را بالای سطح بافر قرار دهید و مطمئن باشید که بافر از آن وارد کیسه نمی شود . در این حالت ممکن است کمی (بسیار کم) تغییر حجم داشته باشید . ( در صورت تفاوت خیلی زیاد در غلظت نمونه و بافر) . زیرا مولکولهای آب نیز طبق قانون انتشار دوست دارند از جایی که غلظت آن زیاد است ، به جایی که غلظت آن کم است ، حرکت کنند . در حقیقت نمونه ، که دارای غلظتی از یونها می باشد ، از لحاظ غلظتی آب کمتری دارد نسبت به بافر که فاقد یون است . این امر باعث جابجایی جزئی آب از بافر به سمت نمونه می گردد . هر چند این تفاوت بسیار اندک است ، اما تأثیر گذار است .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
جدول تعیین درصد ژل آکریل آمید و آگاروز برحسب جرم مولکولها
درصد آکريل آميد مناسب براي جداسازي پروتئين هايي با جرم هاي مولکولي متفاوت
از ژل 12.5 درصد به بالا مولکول هایی که جرم آن بالاتر است در ژل حرکت و معنای چندانی ندارد . مثلا در ژل 12.5 درصد ماکزیمم جداسازی 100 می باشد , پس مولکول هایی که جرم آنها بزرگتر از 100 است , در ژل حرکت چندانی ندارند .
درصد آگاروز مناسب براي جداسازي DNA
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
یک رادیکال آزاد که به عنوان یک آغازگر , پلیمریزاسیون ژل آکریل آمید را سبب می شود , از یکی از این دو راه تولید می شود . پروکسید یا روش فوتوشیمی . عمومی ترین روش استفاده از آمونیوم پرسولفات به عنوان یک پروکسید آغازگر است . و از TEMED به عنوان یک تسریع کننده یا (کاتالیزور) استفاده می شود .
برای پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی از ریبوفلاوین riboflavin و اشعه UV به عنوان آغازگر استفاده می شود و از TEMED به عنوان یک کاتالیزور استفاده می شود . به محلول ژل اشعه ماوراء بنفش تابانده می شود . یک لامپ فلورسنت واکنش فوتوشیمی را آغاز خواهد کرد .
پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی در مواقعی که باید قدرت یونی در ژل پایین باشد , مورد استفاده قرار می گیرد . زیرا در این روش فقط یک مقدار بسیار جزئی از ریبوفلاوین لازم است . همچنین در مواقعی که پروتئین در مقابل آمونیوم پرسولفات خیلی حساس است یا به وسیله پروکسید وارد پلیمریزاسیون می شود , از این روش استفاده می گردد .
پلیمریزاسیون آکریل آمید یک واکنش گرمازاست . پلیمریزاسیون سریع گرمای زیادی تولید می کند . این امر انتقال برق را در ساختمان ژل ناهمگون می نماید و گاهی باعث شکسته شدن شیشه آن می شود . این مشکل به طور ویژه در ژلهایی با غلظت بالا (>T 20% ) دیده می شود . برای جلوگیری از گرمای زیاد باید غلظت آغازگر – کاتالیزور را طوری تنظیم کرد , که پلیمریزاسیون در مدت 20-60min کامل شود .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
جهت كاهش حجم و تغليظ و تخلیص پروتئينها , از روشهای مختلف رسوب دهی مانند رسوب دهی به وسيله نمك ، حلال های آلی و حلال های پليمری استفاده می شود .
رسوب دهی به وسيله نمك :
روش عمومی براي انجام عمل رسوب دهی استفاده از نمك است كه با افزايش مقدار نمك حلاليت پروتئينی كم شده و به هم پیوسته و رسوب می کند . قدرت رسوب دهی نمك ها , به صورت ذرات آنيوني و كاتيون در زیر نشان داده شده است .
از طريق هيدراته شدن یونهای مثبت و منفی نمك افزوده شده در محلول و دور كردن مولكولهای آب از سطوح هيدروفوب پروتئينها و درنتيجه اين سطوح هيدروفوب به هم پيوسته و رسوب می نمایند .
رسوب دهی به وسيله حلال های آلی :
با افزايش حلال آلی ، قدرت حلاليت مولكولهای باردار آب دوست پروتئينها در محيط آبی كم شده و باعث به هم پيوستن ذرات مولكولی و رسوب دهی آنها می شود . ( مانند مكانيزم رسوبدهی پروتئين ها در نقطة ايزوالكتريك , در غلظتهای پايين نمك) . به عنوان مثال اتانل , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی بسيار مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
رسوب دهی به وسيله پليمرهای آلي :
این روش , مانند روش استفاده از حلال آلی و از طريق كاهش فعاليت محيط آبی است. به عنوان مثال Poly Ethylen Glycol , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی , فراوان مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
افینیتی کروماتوگرافی یکی از روش های جداسازی نمونه های پروتئینی است که خیلی زیاد مورد استفاده قرار می گیرد و بسیار گزینش پذیر و مؤثر است . این تکنیک بر پایه اثرات متقابل منحصر به فرد موجود بین یک مولکول و یک لیگاند متصل به یک ماتریکس است .
کارهای لازم برای طراحی یک افینیتی کروماتوگرافی عبارتند از :
1- پیدا کردن یک لیگاند که ویژگیهای کافی داشته باشد .
2- پیدا کردن شرایط مناسبی که در آن لیگاند و پروتئین هدف به هم متصل شوند . همچنین به همان راحتی هم بتوانند از هم جدا شوند .
مراحل کار با کروماتوگرافی افینیتی را می توان به 3 مرحله اصلی تقسیم کرد .
1-Equilibration :
اولین قدم در کروماتوگرافی افینیتی آماده سازی فاز ساکن است . فاز ساکن معمولا ترکیبی است حل نشدنی از یک پلیمر هیدروفوبیک , برای مثال , آگاروز . باید این فاز را با بافرهای لازم به تعادل رساند و شرایط را برای چسبیدن پروتئین هدف آماده کرد .
2-Application of Sample :
در یک نمونه که حاوی انواع مختلف پروتئین می باشد , پروتئین هدف جلب فاز ساکن می شود , به آن متصل می شود و سایر پروتئین ها به راحتی از میان فاز ساکن عبور می کنند و شسته می شوند . موفقیت این بخش , به مقدار توانایی مولکول هدف برای متصل شدن به لیگاند بستگی دارد . ثابت تفکیک (KD) وابسته است به مقدار نیروی موجود بین مولکول هدف و لیگاند . (KD) کمتر یعنی پیوند قویتر . مقدار (KD) بین 10 به توان 4- و 10 به توان 6- ایده آل برای متصل شدن پروتئین هدف و فاز ساکن می باشد . اگر (KD) بسیار بزرگ باشد , پروتئین هدف به ستون نمی چسبد . اگر (KD) خیلی کوچک باشد , پروتئین هدف به سختی به لیگاند ها متصل می شود و به صورت برگشت ناپذیر جذب آن می شود . در طی شستشو , به استثنای پروتئین هایی که محکم به فاز ساکن چسبیده اند , اغلب مولکولهایی که دارای اثرات متقابل ضعیف هستند , توسط مثلا , یک محلول حاوی غلظت بالای نمک , شسته می شوند .
3-Elution :
به دنبال شست و شو در مرحله آزاد سازی پروتئین ها به صورت یک باند از فاز ساکن جدا می شوند . پس از اینکه نمونه هدف به فاز ساکن چسبید , گرادیانت بافر لازم است . در کروماتوگرافی افینیتی باید شرایط چسبیدن و شرایط رها شدن به راحتی فراهم شود .
2 راه برای شست و شوی مولکول هدف از فاز ساکن وجود دارد .
1- تغییرمقدار (KD) از کم به زیاد . مقدار (KD) ایده آل برای شست و شو معمولا بین 10 به توان 1- و 10 به توان 2- می باشد . همچنین مقدار (KD) می تواند با تغییر شرایط عوض شود . شرایطی مثل غلظت نمک , PH و دما .
2- اضافه کردن ماده ای که به عنوان رقیب به لیگاند متصل شود و باعث آزادی پروتئین هدف شود . یا ماده ای که به عنوان رقیب به پروتئین هدف متصل شود و همراه آن , به وسیله بافر از ستون و فاز ساکن شسته شود .
شکل شماره 2 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله پروتئین های رقیب
شکل شماره 3 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله لیگاندهای رقیب
مولکولهای هدف :
3 گروه از مولکولهای هدف وجود دارند که می توان در آن از روش افینیتی کروماتوگرافی استفاده کرد .
1- اتصالات ویژه مستقر بر روی مولکولهای زیستی فعال : این مولکولها شامل رسپتور , آنتی بادی وآنزیم های فعال می باشند . این مولکولها توسط لیگاندهای طبیعی خود یا لیگاند های شبیه به آن مورد استفاده قرار می گیرند .
2- گروههای مصنوعی که روی مولکولهای طبیعی قرار گرفته اند : برای مثال پلی ساکارید ها . این کار برای جداسازی گروهی آن سودمند است .
3- مولکولهای مهندسی شده که شامل یک برچسب افینیتی است : برای مثالی از این نوع برچسبها GST مخفف Glutathione-S-Transferase یا پروتئین هایی با هیستیدین قابل دسترسی . این برچسب ها اکثرا مهندسی شده تا پروتئین ها جداسازی شوند .
لیگاندهایی که فقط مخصوص یک مولکول خاص باشند را کمتر می توان به صورت یک ماتریکس تجاری پیدا کرد . لیگاندهایی که برای یک گروه خاص استفاده می شوند معمولا به صورت تجاری قابل دسترس هستند , زیرا بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند . لیگاندهای کوچک تر ممکن است در بدست آمدن نتایج مشکلاتی را به وجود آورند . یکی از آنها تداخل شکل فضایی است .دیگر مشکل عدم دستیابی به لیگاند است .
شکل شماره 4 : وقتی لیگاند یک فاز ساکن تهیه می شود , اغلب لازم است که دارای یک بازوی بلند باشد , تا مانع از تداخل و اتصال مولکول و لیگاند نشود .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
تالیف مصطفی رضایی طاویرانی، سید امیر مرعشی، زھرا قلنبر و مھرناز مصطفوی
"بیوفیزیک"
تالیف مصطفی رضایی طاویرانی و ھمکاران
مقدمه و مفاهیم اولیه پروتئومیکس
پروتئومیکس روشی معقول براي ایجاد ارتباط بین اطلاعات موجود در توالی نوکلئوتیدي و خصوصیات عملکردي یک سلول میباشد از پروتئومیکس و تکنیکهاي آن در تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی، توصیف موتانتها، شناسایی و توصیف اثر عوامل غیر زنده بر موجود از طریق پروتئینهاي پاسخگو، مقاومت موجود به استرس و غیره در زمینه هاي مختلف از جمله پزشکی، کشاورزي، صنعتی و غیره بطور گسترده استفاده میشود افراد مرتبط با پژوهشهاي پروتئومیکس معمولاً در یک یا چند بخش از این قسمتها فعالیت میکنند .
جداسازي پروتئینها
تمامی تکنولوژیهاي پروتئومیکس به توانایی ما در خالص سازي و تفکیک اجزاء یک مخلوط پروتئینی وابسته است .
شناسایی پروتئینها
معمولاً توالی یک پروتئین بهترین شناسۀ آن است. روشهایی مانند روش توالی یابی ادمن به طور سنتی براي این منظور استفاده می شده اند، اما این روشها در کارهاي پروتئومیکس نمیتوانند کاربرد گسترده اي داشته باشند چرا که سرعت بسیار پایینی دارند درحال حاضر روشهاي طیف سنجی جرمی براي این منظور استفاده میشوند . داده اي که از این روشها بدست می آید معمولاً یکسري وزن مولکولی قطعات پپتیدي (اثر انگشت جرمی پپتید) و یا در دستگاه هاي پیشرفته تر چند توالی کوچک از بخشهاي مختلف پروتئین است. بعداً این داده ها را میتوان با داده هاي موجود در بانکهاي اطلاعاتی توالی پروتئینها مقایسه کرد و پروتئین مورد مطالعه را شناسایی نمود. امروزه از تراشه هاي پروتئینی هم ممکن است استفاده شود و پروتئینها را برحسب ویژگیهاي اتصالی آنها (که میتواند منحصر به فرد باشد) شناسایی میکنند .
اندازهگیري میزان پروتئین
براي اندازه گیري پروتئین از رنگ آمیزي معمولی ژلها به همراه نرم افزارهاي آنالیز تصویر میتوان استفاده کرد. در رنگ آمیزي افتراقی، دو نمونه مختلف به وسیله دو رنگ فلورسانت متفاوت برچسب گذاري میشوند و به طور همزمان روي ژل از همدیگر تفکیک می گردند. از روي رنگی که هر لکه روي ژل دارد میتوان به میزان بیان پروتئین درهریک از نمونه ها پی برد. روشهاي مختلفی نیز براي آنالیزهاي غیروابسته به ژل طراحی شده اند که از میان آنها میتوان به برچسب گذاریهاي تمایلی اشاره نمود .
آنالیزهاي محاسباتی توالی پروتئینها
مهمترین هدف در این بخش شناسایی یک پروتئین مجهول از میان یک بانک اطلاعاتی بزرگ از پروتئینهاست ، اما شناسایی دومینها ، پیشبینی عملکرد پروتئینها و شناسایی روابط تکاملی پروتئینها هم در این بخش مد نظر است .
پروتئومیکس ساختاري
در این بخش تلاش میشود ساختار سه بعدي پروتئینهاي یک پروتئوم با سرعت قابل قبولی تعیین گردد. در حال حاضر از ابزارهایی نظیر کریستالوگرافی اشعه X و نیز NMR براي این منظور بهره برده میشود .
پروتئومیکس برهمکنشها یا اینتراکتومیکس
در این بخش برهمکنش پروتئینها مورد مطالعه قرار میگیرد. مهمترین ابزاري که براي این منظور استفاده گردیده تکنیک دوهیبریدي مخمر (Y2H) میباشد. از تراشه هاي پروتئین نیز براي شناسایی برهمکنشها استفاده میشود .
شناسایی تغییرات پروتئینها
تقریباً تمامی پروتئینها کم وبیش با آنچه که از ترجمه خالص رونوشت ژنی آنها پیش بینی میشود تفاوتهایی دارند که به خاطر تغییرات شیمیایی پس از ترجمه حاصل شده است. روشهاي خاصی براي مطالعه این تغییرات ابداع شده اند که از میان آنها میتوان به فسفوپروتئومیکس (مطالعه فسفریله شدن پروتئینها) و گلیکوپروتئومیکس (مطالعه گلیکوزیله شدن پروتئینها) اشاره نمود .
پروتئومیکس سلولی
هدف این بخش، که قدمت چندانی ندارد، شناسایی محل دقیق پروتئینها و نوع برهمکنشهاي پروتئینی در رخدادهاي مختلف سلولی است. از جمله ابزارهایی که دراین بخش مورد استفاده قرار می گیرند میتوان به توموگرافی اشعه X و میکروسکوپ فلورسانس اشاره نمود .
برای داشتن دیدی بهتر و جهت دانلود خلاصه این کتاب شامل بخشهای زیر:
1- مقدمه و مفاهیم اولیه پروتئومیکس
2- تاریخچه پروتئومیکس
3- کاربردهای پروتئومیکس
4- وضعیت پروتئومیکس در جهان
5- دورنمای پروتئومیکس
همچنین مقالات زیر که در مورد پروتومیکس می باشد را مطالعه فرمایید .
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
