در روشهای آماده سازی نمونه ، رسوب دادن پروتئین ها به عنوان یک مرحله اختیاری تلقی می گردد . این روش برای جدا کردن انتخابی پروتئین ها از مواد آلاینده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها ، دترجنت ها ، اسیدهای نوکلئیک ، و غیره به کار گرفته می شود . از این روش برای تغلیظ پروتئین های موجود در یک نمونه که در حالت عادی بسیار رقیق باشند ، نیز استفاده می شود .
باید توجه داشت که هیچ روش رسوب دهی به طور کامل کارامد نیست و برخی از پروتئین ها بعد از رسوب داده شدن ، مجددا محلول نمی شوند . به همین دلیل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی استفاده کردن از این روش را در دستور کار می توان قرار داد . در صورتیکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترین نمایه دو بعدی یک نمونه باشد ، باید از انجام رسوبدهی صرف نظر کرد .
جزء به جزء کردن نمونه(Fractionation)
پروتئین هایی که در بافتهای اوکاریوتی بیان می شوند ، از گوناگونی بسیاری برخوردار بوده ، و دارای محدوده دینامیک (محدوده غلظت پروتئین های داخل یک نمونه بین کمترین تا بیشترین غلظت(Range Dynamic) ) وسیعی هستند . برخی از مواقع در نمونه هایی این چنین ، به منظور کاهش پیچیدگی نمونه و افزایش تعداد پروتئین هایی که دارای نسخه پایین هستند ، نمونه جزء به جزء می شود . می توان از روشهای متفاوتی مانند جزء به جزء کردن اجزاء سلولی (Sub-Cellular Fractionation) ، الکتروفورز در فاز مایع ، کروماتوگرافی جذبی و رسوبدهی انتخابی بهره برد . استخراج پی در پی (Sequential Extraction) پروتئین ها از یک سلول یا بافت بر اساس حلالیت آنها در دسته ای از بافر ها که قدرت و خاصیت محلول سازی آنها به تدریج افزایش پیدا می کند ، روش دیگری از جزء به جزء کردن است .
زمانی که قسمتی از پروتئین های سلول یا بافت مورد نظر باشد ، می توان در حین آماده سازی ، نمونه را نیز جزء به جزء کرد . اگر پروتئین هایی از یک قسمت زیر سلولی خاص مورد نظر باشند ، برای مثال ریبوزوم ها ، می توان ارگانل مورد نظر را توسط سانتریفوژ کردن تمایزی در شیبهای سوکروز جدا نمود . اگر چه این روشها را می توان در سلولهای پستانداران که معمولا دارای جداره سلولی ضعیفی هستند ، نیز به کار برد ، اما دسترسی به اورگانل ها در میکرواورگانیسم های دیگر بسیار مشکل است ، زیرا یک روش لیز کردن برای شکستن کارامد دیواره سلولی مورد نیاز است که در عین حال نباید آنقدر خشن باشد که باعث از بین رفتن ارگانل و تخریب آن شود .
رسوبدهی انتخابی بعضی از کلاسهای پروتئینی توسط استن-TCA صورت می گیرد . دیگر روش ، روشهای عصاره گیری متوالی با بافرهایی که به تدریج قدرت محلول سازی آنها افزایش می یابد ، است . مثلا بافرهای مائی ، حلالهای آلی نظیر اتانول ، کلروفورم و اتانول و محلول های حاوی دترجنتهای مختلف . بالاخره روشهای جداسازی کروماتوگرافی ، الکتروفورز در فاز مائی نیز در جزء به جزء کردن نمونه ها بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی متفاوت پروتئینهای موجود در نمونه قابل انجام هستند . تصمیم در انتخاب هر یک از این روشها بستگی به ماهیت نمونه و هدف از کار با نمونه دارد .
روشهای جزء به جزء کردن ، ممکن است مزایای بسیاری در غنی سازی پروتئین ها داشته باشند ، اما اصلی ترین نکته منفی در استفاده از این روشها ، این است که بسیار زمانگیر و بسیار پیچیده اند . همچنین نمی توان در یک زمان چند نمونه را وارد این مرحله از کار نمود . اما مزیت اصلی آن ،تعیین جایگاه پروتئین ها از نظر ساختمانی در زیر ساختار سلولی و تعیین عملکرد آنها است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در حین لیز سلولی و بعد از آن ، ترکیبات تداخل کننده ای نظیر آنزیمهای پروتئولایتیک ، نمکها ، لیپیدها ، اسیدهای نوکلوئیک ، پلی ساکاریدها ، و فنل های گیاهی باید غیر فعال شده یا از نمونه تهیه شده خارج گردند .
در این بخش به توضیح این آلاینده ها و اثر آنها بر الکتروفورز 2 بعدی پرداخته و روشهای حذف آنها را شرح خواهیم داد .
پروتئازها
پروتئازهای موجود و حاضر در نمونه باید غیر فعال شوند تا از تخریب پروتئین ها جلو گیری شود . در غیر این صورت پروتئازها با شکستن پروتئین ها سبب پدیدار شدن نقاط مصنوعی در نمایه 2 بعدی می شوند . روشهای مختلفی برای مقابله با پروتئولیز ضمن آماده سازی نمونه وجود دارد . برای مثال استخراج پروتئین در PH بازی ، جوشاندن نمونه در SDS و همچنین استفاده از مهار کننده های پروتئازها (PI) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر .
مهار کننده های پروتئاز را می توان به محلول لیز کننده افزود ، اما همیشه این کار توصیه نمی شود . چرا که این مواد ممکن است باعث ایجاد تغییر بار الکتریکی در پروتئین های دیگر شده و سبب ایجاد نقاط مصنوعی شوند . راه حل های دیگر جوشاندن نمونه در بافری با PH بالا نظیر بافر تریس است که دارای SDS باشند . برای غیر فعال کردن پروتئاز ها با PH پایین از رسوب دادن با TCA 20% بر روی یخ می توان بهره برد .
این نکته را باید در نظر داشت که غیر فعال سازی کامل تمام پروتئازها کاری بسیار سخت است . رسوب دهی توسط TCA و استن در کاهش تخریب پروتئین ها و خارج ساختن ترکیبات تداخل کننده معمولا مفید است . اما باید کاملا مراقب بود که پروتئین ها در اثر رسوب دادن ناقص و یا بعد از رسوب دادن ، در حین محلول کردن دوباره ، از دست نروند . نشان داده شده است که محلول های حاوی تیواوره 2 مولار و اوره 7 مولار کارآیی قابل توجهی در مهار کردن پروتئازهای نمونه دارند . تیواوره علاوه بر مفید بودن در حل کردن پروتئین ها به عنوان یک مهار کننده قوی پروتئازها نیز عمل می کند .
اسیدهای نوکلوئیک
حضور اسیدهای نوکلوئیک نیز می تواند در حین IEF مسئله ساز شود . این امر ناشی از افزایش در ویسکوزیته نمونه و در بعضی از موارد ایجاد کمپلکس هایی با پروتئین ها ی نمونه است که منجر به مهاجرت غیر عادی و ایجاد رگه های افقی و عمودی در نمایه ژل الکتروفورز 2 بعدی می شود . اگر مشکلاتی از این قبیل بوجود آید بهترین کار متلاشی کردن اسید نوکلوئیک با یک اندونوکلوئاز خالص و مناسب و عاری از پروتئاز است . روش دیگر استفاده از توانایی آمفولیت ها در ایجاد کمپلکس با اسیدهای نوکلوئیک و بعد خارج کردن این کمپلکس ها با اولترا سانتریفوژ است .
نمک ها
نمکها با تغییر در رسانایی و قدرت عبور جریان الکتریکی در ژلهای IPG باعث اختلال در IEF شده و تا زمانی که یونهای نمک از انتهای نوارهای IPG خارج نشوند فوکوسینگ پروتئین ها اتفاق نخواهد افتاد . همین امر زمان فوکوسینگ را افزایش می دهد . حضور نمک در نمونه ، ممکن است باعث جابجایی آب موجود در نوار IPG نیز شود . به طوریکه یک سمت ژل خشک و سمت دیگر متورم خواهد شد . از طرف دیگر وجود مقادیر زیاد نمک در نمونه باعث می شود پروتئین ها در نواحی نسبتا عریضی در دو انتهای ژل فوکوس نشوند . به همین دلایل نمک اضافی موجود در نمونه ها باید خارج شوند ، یا به کمترین حد ممکن تقلیل یابند . همانطور که قبلا اشاره شده است باید غلظت نمک موجود در نمونه کمتر از 40 میلی مولار باشد . زمانیکه نمونه در حین خیساندن ژل بار گیری می شود ، باید غلظت نمک کمتر از 10 میلی مولار باشد .
برای نمک زدایی از روشهای مختلفی می توان استفاده کرد ، که رایج ترین آنها استفاده از دیالیز ، تغلیظ کننده های غشائی ، ژل فیلتراسیون و رسوب دهی است . دیالیز روشی بسیار کارامد است ، که در آن کمترین مقدار از نمونه از دست داده می شود . اما دارای روندی طولانی مدت است و احتیاج به حجم بالایی از محلول دارد . تغلیظ کننده ها ی غشایی یا دیالیز همراه با سانتریفوژ روش سریع تری هستند . اما امکان اتصال پروتئین ها با غشاء دیالیز در این روش بیشتر است . در ژل فیلتراسیون نیز امکان از دست رفتن پروتئین های نمونه زیاد است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (دترجنت ها)
دترجنت ها
دترجنت ها مولکولهای آمفیپاتیک (Amphipathic) هستند . یعنی در ساختا خود هم گروه آب گریز و هم گروه قطبی دارند . این مولکولها دارای گروه قطبی در انتهای یک زنجیره کربنی طویل و آبگریز هستند . به همین دلیل مولکولهای آمفیپاتیک در آب رفتار منحصر به فردی از خود نشان می دهند . گروههای قطبی آنها با مولکولهای آب پیوند هیدروژنی تشکیل می دهند . در حالیکه زنجیره های هیدروکربنی آنها ، با ایجاد بر هم کنشهای آب گریز ، به یکدیگر اتصال می یابند . این ساختار خاص به میسل (Miccelle) موسوم است . دترجنتها به دلیل همین خاصیت آمفیپاتیک خود قادرند ترکیبات هیدروفوب را در آب حل کنند .
در بافر محلول سازی ، دترجنت ها تقویت کننده اثر معرفهای کائوتروپیک هستند . این مواد در ممانعت از ایجاد بر هم کنشهای آب گریز بین گروههای داخلی ، که بر اثر عملکرد معرف های کائوتروپیک در معرض محیط خارجی قرار گرفته اند ، نقش مؤثری در محلول سازی ایفا می کنند . عدم محافظت از این گروههای آب گریز خطر از دست دادن پروتئین ها را به دلیل توده شدن در بر دارد . این مسئله به خصوص در مورد پروتئین های هیدروفوبیک ، نظیر پروتئین های غشائی ، که دارای چندین گروه آی گریز هستند ، بارزتر است .
دترجنتها در محلول ساختن پروتئین های غشائی مانند محیط 2 لایه لیپیدی غشاهای بیولوژیک عمل می کنند . این مواد از قسمت آب گریز خود داخل 2 لایه لیپیدی شده با گروههای آب گریز ایجاد پیوند می کنند . همین امر پخش شدن این گروهها را در محیط آبی از طریق تشکیل میسلهای دترجنتی امکان پذیر می کند .
دترجنت ها بر اساس ماهیت سر قطبی خود به دترجنت های یونی و غیر یونی و دو یونی طبقه بندی می شوند . از این میان فقط دترجنتهایی غیر یونی یا دو یونی اجازه مهاجرت پروتئین ها را در ایزوالکتروفوکوسینگ می دهد . دترجنتهایی مثل SDS با IEF سازگاری ندارند .
از دترجنتهای غیر یونی که در الکتروفورز دو بعدی استفاده می شوند ، NP40 و Triton X-100 در غلظتهای 4 – 0.4% رایجترین ها هستند . دترجنتهای دو یونی از دسته سولفوبتائین ها (Sulfobetaines) نسبت به دترجنتهای غیر یونی ارجحیت دارند . سولفوبتائین ها اولین انتخاب برای انجام IEF هستند و در غلظت های بین 2 – 4% مورد استفاده قرار می گیرند . از سولفوبتائین ها CHAPS و CHAPSO و از مشتقات سولفوبتائین های خطی نظیر SB3-10 و آمیدوسولفوبتائین ASB-14 هستند . برای محلول سازی پروتئین های غشائی گاهی مواقع Triton X-100 به مقدار کم ، 0.5% به یک دترجنت سولفوبتائین اضافه می شود . البته برخی از پروتئین ها برای حل شدن به غلظت بالای 4% از دترجنت ها نیازمندند .
به هر حال SDS رایج ترین دترجنت مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها است . خصوصیات شگفت انگیز SDS در محلول سازی پروتئین ها ناشی از تمایل شدید آن در پیوند با پروتئین هاست ، به طوریکه تقریبا یک مولکول SDS به هر دو اسید آمینه موجود در مولکول پروتئین اتصال می یابد . به این ترتیب به خاطر سر آنیونی SDS ترکیب پروتئین و SDS بیشترین حلالیت در آب را خواهد داشت . از دیگر مزایای استفاده از آن جلوگیری از تشکیل اولیگومرها است . گاهی اوقات اورگانیسم هایی با دیواره سلولی محکم ، قبل از اینکه در بافر محلول سازی لیز شوند ، به مدت 5 دقیقه در SDS 1-2% جوشانده می شوند . در استخراج بسیاری از پروتئین های هیدروفوبیک نیز به درصد بالایی از SDS نیاز است . به هر حال قبل از الکتروفورز ، SDS باید با جایگزینی رقیب در بافر محلول سازی از آن خارج شود . برای این کار در ابتدا نمونه حل شده در SDS با بافر محلول سازی رقیق می شود تا جایگزینی دترجنت های رقیب با SDS صورت پذیرد . برای خارج ساختن SDS ممکن است بعد از محلول سازی ، پروتئین ها توسط روش TCA-Acetone رسوب داده شوند . در صورت استفاده از این روش ممکن است رسوب حاصل مجددا به راحتی قابل حل شدن نباشد . اضافه کردن حجم کمی از سود 0.1 مولار می تواند برای غلبه بر این مشکل بسیار کارامد باشد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
به خاطر تفاوت در ماهیت و ساختار در انواع نمونه ها , روشهای آماده سازی برای نمونه هایی که از منابع مختلف به دست می آیند , با هم اختلاف دارند . در ذیل این مقاله ، این نمونه ها را به انواع مختلف تقسیم بندی کرده ، در مورد آن توضیح می دهیم .
1- نمونه های محلول :
نمونه های محلول و مایع نظیر ، سرم ، پلاسما ، مایع نخاعی و عصاره مایع سلولها و بافتها را می توان در اکثر موارد با کمترین تغییر و دستکاری ، توسط الکتروفورز 2 بعدی بررسی و مطالعه کرد .
نمونه هایی مانند سرم و پلاسما را که دارای غلظت بالایی از پروتئین ها هستند ؛ را می توان با رقیق سازی توسط بافرهای محلول کننده مناسب ، برای انجام تست الکتروفورز 2 بعدی آماده کرد . در این روش بالا بودن غلظت بعضی از پروتئین ها ، مثل آلبومین و یا ایمونوگلوبین ها ، می تواند باعث پوشاندن بعضی از پروتئین ها که غلظت کمی دارند گردد . با خارج کردن این پروتئین ها می توان این مشکل را از بین برد . اما با خارج کردن این پروتئین ها ممکن است ، بعضی دیگر از پروتئین ها نیز خارج گردد .
2 موضوع دیگر نیز ممکن است ، در الکتروفورز 2 بعدی ایجاد مشکل نماید .
الف- وجود نمک های اضافی در محلول
ب- غلظت کم پروتئین ها در محلول
مشکل اول را می توان با دیالیز نمونه و یا کروماتوگرافی با sephadex G25 حل کرد و نمک های اضافی را از نمونه خارج کرد . مشکل دوم را می توان با رسوب دادن پروتئین ها ، به وسیله موادی که باعث رسوب کردن آنها می شود ، حل کرد . موادی مثل ؛ آمونیوم سولفات ، TCA ، یا استن . همچنین می توان با خارج کردن آب از نمونه ، آن را غلیظ کرد . مثل دیالیز در مقابل پلی اتیلن گلایکول و یا لیوفیلیز کردن نمونه .
رسوب دادن نمونه با استن – TCA برای غیر فعال کردن پروتئاز ها و خارج کردن مولکولهای تداخل کننده و برای تغلیظ پروتئین های بسیار قلیایی ، مثل پروتئین های ریبوزومی ، در محلول لیز شده سلولی بسیار مفید می باشد .
2- نمونه های بافتی :
برای تهیه نمونه از بافت جامد , معمولا بافت را توسط بافر محلول کننده ، حل می کنند . بهترین روش استفاده از نیتروژن مایع است . نمونه های کوچک را که در یک فویل آلومینیومی قرار دارد و در نیتروژن مایع , یخ زده است ، را می توان به راحتی در یک هاون خرد کرد . نمونه های بزرگ را می توان با هموژنه کردن در بافر محلول کننده ، توسط هموژنایزر آماده کرد . برای اینکه بتوان از آسیب پذیری پروتئین ها در اثر حرارت جلوگیری کرد ، باید حرارت تولید شده توسط هموژنایزر را از محیط نمونه خارج کرد .
مشکل خاص در آنالیز نمونه های بافتی ، عدم وجود یک دستی در ماهیت بافت است . همانطور که می دانیم بافت ها از انواع مختلف سلول تشکیل شده است . حتی یک نوع سلول نیز ممکن است از اختلاط سلولهای سالم و ناسالم تشکیل شده باشد . روشهای مختلفی برای جداسازی و تفکیک این سلولها وجود دارد . با استفاده از گزینش مثبت یا منفی و معمولا بر اساس یک روش ایمونوافینیتی ، امکان غنی سازی یک سلول خاص از جمعیت کل آنها و کشت آن قبل از انجام تست وجود دارد . همچنین از روشهای میکروسکوپی مانند (Laser Capture microdessection LCM ) نیز می توان برای جداسازی آنها استفاده کرد .
البته روش LCM برای آنالیز اسیدهای نوکلئیک بهتر است ، چون در کنار آن از PCR برای تولید و تقویت اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود ، اما در آنالیز پروتئین ها ، دستگاهی که کار PCR را انجام دهد و پروتئین ها را افزایش دهد ، وجود ندارد .
3- نمونه های سلولی :
نمونه هایی که در محیط آزمایشگاه به صورت سوسپانسیون رشد داده می شود و یا نمونه هایی مانند خون ، لنفوسیتها و غیره را سانتریفوژ کرده ، توسط PBS (بافر فسفات سالین) شستشو کرده و در بافر محلول کننده حل می نمایند .
سلول هایی که در محیط جامد کشت داده می شوند را ابتدا باید از محیط کشت جدا کرد . قبل از جدا کردن سلول ها بهتر است آنها را با یک بافر ایزوتونیک شستشو کرد . برای این منظور محلول ایزوتونیک سوکروز پیشنهاد می گردد . زیرا یونهای موجود در بافر PBS ممکن است در نتیجه الکتروفورز تأثیر منفی گذاشته و تداخل ایجاد نماید . در صورت استفاده از PBS می توان نمونه را قبل از انجام تست ، دیالیز کرد . پس از شستشو سلول ها را توسط لوپ یا اسکراپر برداشته و در بافر محلول کننده حل نمایید .
در صورتی که نمونه حاوی مقادیر زیادی اسید نوکلئیک باشد ، ویزکوزیته آن بالاست . در این مورد می توان از RNase و DNase استفاده کرد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
جهت كاهش حجم و تغليظ و تخلیص پروتئينها , از روشهای مختلف رسوب دهی مانند رسوب دهی به وسيله نمك ، حلال های آلی و حلال های پليمری استفاده می شود .
رسوب دهی به وسيله نمك :
روش عمومی براي انجام عمل رسوب دهی استفاده از نمك است كه با افزايش مقدار نمك حلاليت پروتئينی كم شده و به هم پیوسته و رسوب می کند . قدرت رسوب دهی نمك ها , به صورت ذرات آنيوني و كاتيون در زیر نشان داده شده است .
از طريق هيدراته شدن یونهای مثبت و منفی نمك افزوده شده در محلول و دور كردن مولكولهای آب از سطوح هيدروفوب پروتئينها و درنتيجه اين سطوح هيدروفوب به هم پيوسته و رسوب می نمایند .
رسوب دهی به وسيله حلال های آلی :
با افزايش حلال آلی ، قدرت حلاليت مولكولهای باردار آب دوست پروتئينها در محيط آبی كم شده و باعث به هم پيوستن ذرات مولكولی و رسوب دهی آنها می شود . ( مانند مكانيزم رسوبدهی پروتئين ها در نقطة ايزوالكتريك , در غلظتهای پايين نمك) . به عنوان مثال اتانل , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی بسيار مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
رسوب دهی به وسيله پليمرهای آلي :
این روش , مانند روش استفاده از حلال آلی و از طريق كاهش فعاليت محيط آبی است. به عنوان مثال Poly Ethylen Glycol , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی , فراوان مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
